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食管癌（esophageal cancer,EC）是一种常见的消化道恶性肿瘤,位于全球肿瘤发病率的第8位,死亡率的第6位。我国食管癌的死亡率居世界首位,虽然近年来食管癌的死亡率有所下降,但下降并不明显,在一些食管癌的高发区,其发病率和死亡率仍然维持较高水平。因早期症状不是很明显,大部分就诊时已是中晚期食管癌患者,进行手术切除治疗的5年生存率仅为25%左右,在全部就诊的患者中,5年生存率不足10%。但是,如果早期发现,食管癌手术切除治疗后的5年生存率可达约90%以上,10年生存率可达约73%。探讨食管癌的发病机制,以实现食管癌的早发现、早诊断、早治疗已经成为目前临床和基础研究的主要方向之一。但是,迄今为止,食管癌的病因和发病机制仍然不明确,所以,有关食管癌的研究仍然很严峻。随着分子生物学的发展以及各种分子生物学技术的的完善和成熟,PCR以及免疫组织化染色法等技术已比较成熟,从而为从分子水平上研究食管癌提供了良好的条件。CTGF（Connective Tissue GrowthFactor）是由早期即刻基因编码的高度保守的CCN（CTGF、Cef10/cyr61和Nov的缩写）多肽家族成员之一,CTGF在血管发生和肿瘤生长中发挥着不同的作用。近年的研究结果发现,CTGF与多种组织器官纤维化有着密切的关系,即CTGF的表达水平与多种恶性肿瘤的发生、发展、转移、侵袭潜能、肿瘤血管生成及其预后有着密切关系。从目前文献报道看,在不同类型的肿瘤,如喉鳞状细胞癌、甲状腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌等CTGF的表达并不一致（有的高表达,有的低表达）,CTGF和肿瘤生长的关系尚无定论。本课题采用实时荧光定量PCR技术和免疫组化方法分析CTGF基因在食管癌原发灶及匹配正常食管组织中的mRNA和蛋白水平的表达及与相关因素的关系,并且对患者进行了术后随访,研究了CTGF基因的表达对患者预后的影响。材料与方法1研究对象的选择、组织样本的采集与患者临床资料的收集研究对象为2004年至2007年在郑州大学第一附属医院和河南省林州市肿瘤医院住院的食管癌患者。手术后采集患者的标本,包括食管癌原发灶及其匹配的正常食管组织,共186对。这些采集到的食管癌样本均通过免疫组化病理切片的手段鉴定正常组织和肿瘤组织,组织标本经外科手术切除后立即放入液氮中,然后放在-80℃冰箱中冷冻保存。临床资料包括性别、年龄、家族史、肿瘤的大小、肿瘤分化程度、肿瘤位置以及是否有淋巴结转移等。2采用Triozl试剂提取食管癌患者组织标本RNA。通过测定RNA的OD值评估RNA含量和纯度。3使用Pormega公司的AMV逆转录试剂盒进行cDNA的逆转录。RT-PCR扩增β-actin检测逆转录效果。4样品中CTGFmRNA水平的测定食管癌患者癌组织及匹配的正常组织中CTGF基因mRNA的表达水平采用实时荧光定量PCR技术测定。模板mRNA的含量通过测定样品中目的基因模板的循环阈值即Ct值来反映。5样品中CTGF蛋白水平的测定186例食管癌患者癌组织及其匹配正常组织中CTGF基因蛋白的表达水平通过免疫组织化学的方法测定。在200倍的显微镜下观察每一个样品标本3个染色最强的视野,同时计数阳性细胞数,并计算阳性细胞百分比。食管癌蛋白表达水平的指标采用每个患者的食管癌组织中阳性细胞百分比与正常食管组织中阳性细胞百分比的比值来表示。6生存分析2008年3-4月期间,对2004年至2007年在郑州大学第一附属医院和林州市肿瘤医院就医并采集到标本的食管癌患者进行随访。患者手术治疗的时间作为生存的起始时间,随访结束的时间作为生存的终止时间,终止时间与起始时间之间的时间间隔作为患者的生存时间。7统计学分析运用统计分析软件SPSS12.0对数据结果进行统计学分析。对于每一个样本,用ΔCt(CtCTGF-Ctβ-actin)值表示目的基因与内参基因β-actin间Ct的差值,Δ（ΔCt）值等于ΔCt（正常食管组织）—ΔCt（食管癌组织）。对Δ（ΔCt）和蛋白的表达水平采用独立样本t检验。不同相关因素间食管癌样本CTGF基因mRNA和蛋白的表达水平差异比较采用χ2检验。绘出CTGF基因表达阳性与阴性的患者Kaplan-Meier生存曲线,两条曲线的差异采用Log-rank（时序检验）来比较。采用Cox回归（比例危险率回归模型）分析相关因素与基因表达对生存时间的影响。以α=0.05作为检验水准。结果1 CTGFmRNA水平与食管癌的关系1.1 CTGF基因在食管癌组织中和匹配的正常食管组织中的mRNA表达水平实时荧光定量PCR结果显示,在186例样品中,与匹配正常食管组织相比,CTGF在82.8%（154/186）的食管癌组织中的表达上调。食管癌组织和正常食管组织中CTGF基因mRNA的表达水平差异具有显著的统计学意义（P=0.000）。1.2 CTGFmRNA在食管癌组织中的表达与相关因素之间的关系淋巴结转移组和有家族史组CTGF mRNA表达水平显著高于淋巴结未转移组和无家族史组（P=0.000,P=0.001）。CTGF mRNA在不同肿瘤体积间、不同的浸润深度间、不同的肿瘤分化程度间表达水平的差异具有统计学意义（P=0.000,P=0.000,P=0.000）。而CTGFmRNA的表达水平与其他一些因素（性别、年龄、肿瘤病理形态类型、肿瘤位置）无关。2 CTGF蛋白水平与食管癌的关系2.1 CTGF基因在食管癌组织中与正常食管组织中蛋白水平的表达配对t检验结果显示,CTGF基因在食管癌组织中蛋白的表达水平显著高于其匹配的正常食管癌组织（P=0.000）,与real-time PCR结果相一致。2.2 CTGF蛋白在食管癌组织中的表达与相关因素之间的关系淋巴结转移组和有家族史组的CTGF蛋白表达水平显著高于淋巴结未转移组和无家族史组（P=0.000,P=0.000）。CTGF蛋白在不同肿瘤体积间、不同的浸润深度间、不同的肿瘤分化程度间的表达水平差异具有显著的统计学意义（P=0.000,P=0.000,P=0.000）。而CTGF蛋白的表达水平与其他一些因素（性别、年龄、肿瘤病理形态类型、肿瘤位置）无关。与CTGFmRNA表达水平的结果一致。3生存分析3.1食管癌患者单因素生存分析单变量生存分析结果表明,CTGF的mRNA表达、蛋白表达、性别、家族史、浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移和肿瘤分化程度与食管癌患者的生存时间显著相关。CTGFmRNA和蛋白高表达患者的生存时间显著低于CTGF低表达患者的生存时间（P=0.000,P=0.000）。同样,有肿瘤家族史和淋巴结转移患者的生存时间显著低于无家族史和淋巴结未转移患者的生存时间（P=0.0017,P=0.000）,浸润深度与生存时间也存在显著相关（P=0.0012）,浸润到粘膜层生存率比浅肌层高。肿瘤分化程度、性别和肿瘤大小与患者生存时间也存在显著相关（P=0.001,P=0.0104,P=0.0381）,低分化生存时间最低,高分化生存时间最高,男性比女性生存时间长,肿瘤体积越大生存时间越低。年龄、病理形态类型和肿瘤位置与病人的生存时间无相关性。3.2食管癌COX多因素回归分析多因素生存分析（COX回归分析）结果表明,影响食管癌患者生存时间的独立危险因素是CTGFmRNA表达、蛋白表达、家族史、淋巴结转移和肿瘤分化程度,相对危险度分别是5.008（95%CI 1.562～16.057）、1.567（95%CI 1.171～2.681）、1.65（95%CI1.037～2.641）、2.247（95%CI 1.309～3.860）、1.507（95%CI 1.104～2.056）。未发现年龄、肿瘤大小、浸润深度、肿瘤病理形态类型、肿瘤位置与食管癌患者的生存时间有相关性。结论1食管癌组织CTGFmRNA表达水平显著高于其匹配正常食管组织的CTGFmRNA表达水平。CTGFmRNA表达水平与淋巴结转移、家族史、肿瘤体积、浸润深度和肿瘤分化程度相关。2 CTGF蛋白在食管癌组织中的表达水平显著高于匹配正常食管组织中的表达水平。CTGF蛋白表达水平与淋巴结转移、家族史、肿瘤体积、浸润深度和肿瘤分化程度相关。3食管癌患者CTGF高表达的平均生存时间显著低于CTGF低表达的患者平均生存时间。影响食管癌患者生存时间的独立危险因素是CTGFmRNA表达、CTGF蛋白表达、家族史、淋巴结转移和肿瘤分化程度。