姜花HcTPS2特异启动子与HcTPS1植物融合表达载体的构建及遗传转化

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植物的香气是由植物本身含有的不同挥发性物质所决定的,这些物质可分为三大类:萜类、苯基/苯丙烷类、脂肪酸衍生物。萜类化合物是姜花花朵挥发性香气的主要成分,萜类合成酶是催化形成萜类物质的重要关键酶之一。本实验利用从白姜花花瓣中克隆到的花部特异和受伤害、虫害、茉莉酸甲酯诱导的HcTPS2特异启动子启动从姜花中克隆到的沉香醇合成酶基因HcTPS1,对模式植物烟草和无香味的红姜花进行遗传转化,获得拟转基因烟草及具香味的拟转基因红姜花,进一步确认该启动子和基因在不同植物中的功能。主要研究结果如下:  1.结合植物表达载体pOx以及目的基因上酶切位点特点,利用HindⅢ和SacⅠ双酶切将HcTPS2启动子连接到植物表达载体pOx上,得到植物表达载体pOx-pHcTPS2;再通过SpeⅠ和BamHⅠ双酶切将HcTPS1连接到pOx-pHcTPS2上,最后得到植物表达载体pHcTPS2:HcTPS1。  2.采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,经潮霉素筛选后获得抗性植株。利用启动子HcTPS2、目的片段HcTPS1两组特异引物和潮霉素引物以及农杆菌Chva引物对所获得的抗性植株进行了PCR检测,证明获得4株拟转基因烟草。  3.采用农杆菌介导法转化红姜花愈伤组织,经潮霉素筛选后获得抗性植株。利用启动子HcTPS2特异引物和潮霉素引物以及农杆菌Chva引物对所获得的抗性植株进行了PCR检测,得到4株拟转基因红姜花。  4.采用顶空固相微萃取和气相色谱,质谱(GC/MS)技术,对烟草的野生型和拟转基因植株叶片的挥发性成分进行定性定量分析:对拟转基因烟草及野生型烟草进行伤害处理,0.5 h后检测得出拟转基因烟草中产生了倍半萜愈创木烯,16 h后发现拟转基因烟草中出现了单萜罗勒烯,而野生烟草中没有检测到;斜纹夜蛾取食处理后检测发现拟转基因烟草中新生成单萜罗勒烯,拟转基因烟草比野生型烟草中的蒎烯含量高出4倍;茉莉酸甲酯处理后检测出拟转基因烟草中生成了野生型烟草没有的倍半萜法尼烯。进一步证明HcTPS2启动子是诱导型启动子,在不同处理条件下,HcTPS1可以催化形成不同的产物。  5.采用顶空固相微萃取和气相色谱.质谱(GC/MS)技术,对红姜花的野生型和拟转基因植株叶片的挥发性成分进行定性定量分析,对拟转基因红姜花及野生型红姜花进行伤害处理后发现拟转基因红姜花萜类物质发生了明显的改变。拟转基因红姜花中的单萜蒎烯增长了7倍,焦烯增长了22倍;倍半萜榄香烯增长了12倍,石竹烯增加了18倍,香叶烯增加了15倍,香橙烯增加了22倍,长叶蒎烯增加了22倍,α-法尼烯增加了26倍,柏木烯增加了23倍,杜松烯增加了21倍;新生成了大量倍半萜橙花叔醇和金合欢醇、β-金合欢烯,证明HcTPS1在红姜花体内是能催化栊牛儿基二磷酸(GPP)形成单萜,同时又能催化法尼基二磷酸(FPP)形成倍半萜的双功能酶,且以合成倍半萜功能为主。  
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