大豆起源于中国,现已广泛种植于世界各地,为人类提供了大量的蛋白质与油脂。随着全球人口增长以及自然环境的不断恶化,大豆基因功能的研究以及新品种的培育也越来越得到科研人员的关注。CRISPR/Cas9基因编辑技术的开发与应用极大的促进了动植物基因功能研究,传统的SpCas9通过识别NGG或NAG PAM(protospacer adjacentmotif)位点发挥作用,但这些PAM序列在基因组上的分布较为局限。相关研究发现,在水稻与拟南芥等植物中,SpCas9的变体xCas9和SpCas9-NG可将识别范围拓展至NG PAM,但其在大豆中的应用尚未有相关报道。为在大豆中进一步拓展CRISPR的应用,本研究利用xCas9、SpCas9-NG以及整合xCas9和SpCas9-NG突变位点形成的xNGCas9变体,通过设计包括NG、CAG、GAA以及GAT等16个PAM位点的sgRNA,构建基于SpCas9及上述三种变体的CRISPR敲除载体。进一步利用发根农杆菌K599介导的转基因方法获得大豆毛状根,并结合下一代测序技术分析SpCas9及其变体在大豆毛状根中的基因编辑情况。主要结果如下:1、大豆基因敲除载体的构建运用 overlap PCR 的方法,将 SpCas9 突变为 xCas9、SpCas9-NG 和 xNGCas9。共设计了 16 种 PAM 类型,包括有:CGG、CAG、GAT、GAA、AGA、TGA、CGA、GGA、AGC、TGC、CGC、GGC、AGT、TGT、CGT 和 GGT。每种类型选取三种不同的靶基因设计靶点,一共获得192个敲除载体。2、大豆转基因毛状根的获得利用农杆菌介导的大豆毛状根转化法,将上述载体成功转化大豆,每个载体对应获得15个毛状根,共计获得大约2880个大豆毛状根。3、SpCas9变体拓宽了 SpCas9的编辑范围利用下一代测序技术,对大豆毛状根DNA进行基因编辑检测,发现SpCas9变体拓宽了 SpCas9的编辑范围。SpCas9变体将SpCas9的PAM序列由NGG拓展到NG。除此之外,SpCas9-NG在GAA与GAT位点,xNGCas9在GAA位点可以发挥作用。各SpCas9变体与SpCas9相比,能识别更多种类的PAM位点,它们拓宽了 SpCas9介导的大豆基因组编辑范围。4、各SpCas9变体有着不同的编辑特点SpCas9变体都可以对大豆毛状根的基因组发挥作用,但其较SpCas9而言各有特点,xCas9可以在NG PAM位点发挥作用,但效率不高;SpCas9-NG可以在除NGG PAM以外的NG PAM位点发挥较高的编辑效率;xNGCas9也可以在NG PAM位点发挥作用,在NGC位点的效率较高。综上,本研究开发出了新的且适用于大豆的基因编辑系统,这不仅拓宽了CRISPR/Cas9在大豆中的编辑范围,而且为大豆基因功能研究与遗传改良提供有力的分子工具。