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【目的】
探索miR-30a对乳腺癌上皮间质转化和干细胞样表型的影响及可能的作用机制。
【方法】
1.实时定量PCR检测miR-30a在乳腺癌细胞系与正常乳腺细胞系中的基础表达量；建立稳定过表达miR-30a的细胞系，体外实验观察miR-30a对EMT和CSC表型的抑制作用：光镜下观察细胞形态学变化；Westernblot、免疫荧光检测EMT相关分子的表达；乳腺球囊形成实验检测肿瘤细胞的自我更新能力；流式细胞术检测CD44high/CD24low细胞亚群比例及细胞内ALDH活性的变化。
2.生物信息学预测miR-30a潜在靶基因；荧光素酶报告基因实验验证SOX4是否为miR-30a的靶基因；在TCGA数据库中分析miR-30a和SOX4的表达相关性；实时定量PCR检测细胞内miR-30a和SOX4表达量的变化情况。
3.实时定量PCR检测SOX4在乳腺癌细胞系与正常乳腺细胞系中的基础表达量；建立稳定敲低SOX4的细胞系，体外实验观察下调SOX4对EMT和CSC表型的影响。
4.在过表达miR-30a的细胞中同时过表达SOX4(缺失3’UTR)，观察上调SOX4是否削弱了miR-30a对EMT和CSC表型的抑制作用。
5.Westernblot检测TGF-β通路上SMAD2/3、P-SMAD2/3、TGFBR1表达的变化；结合TCGA数据库进行生物信息学分析，进一步验证miR-30a和EMT、CSC以及TGF-β通路的关系。
6.构建乳腺癌原位移植瘤动物模型；免疫组化检测移植瘤中EMT、CSC和TGF-β信号通路相关指标的变化。
7.TCGA数据库分析miR-30a表达与生存的关系；免疫组化实验检测乳腺癌组织中SOX4的表达，分析SOX4的表达情况与临床病理参数的相关性及其对生存预后的影响。
8.实时定量PCR检测小分子化合物双硫仑能否上调乳腺癌细胞中miR-30a的表达，进而达到发挥miR-30a肿瘤抑制因子的作用。
【结果】
1.过表达miR-30a的乳腺癌细胞相较于对照组中，EMT和CSC表型均被抑制：对照组中加入TGF-β可诱导细胞发生EMT，其形态由典型的极性、鹅卵石样变为非极性、长梭形的间质细胞样，而过表达miR-30a的细胞可对抗这种由TGF-β诱导的细胞形态改变；过表达miR-30a的细胞系中E-cadherin表达上调，Vimentin、ZEB1、Snail1表达下调；乳腺球囊形成能力减弱；CD44high/CD24low细胞亚群比例降低，细胞内ALDH活性下降。
2.分析microRNA靶基因预测结果，选择SOX4作为miR-30a的靶基因；荧光素酶报告基因实验证实SOX4是miR-30a的靶基因；TCGA数据库分析发现miR-30a和SOX4的表达情况呈现明显的负相关性；实验发现，在细胞中上调SOX4表达，miR-30a表达明显下降；而敲低SOX4后，miR-30a表达明显上调，二者之间形成双向负反馈环。
3.SOX4在正常乳腺细胞系中表达明显低于乳腺癌细胞系；实验发现，敲低SOX4后细胞对TGF-β诱导的EMT形态变化有抵抗作用，且细胞中E-cadherin表达上调，Vimentin、ZEB1、Snail1表达下调；乳腺球囊形成能力下降；CD44high/CD24low细胞亚群比例降低，ALDH活性下降。
4.在过表达miR-30a的细胞中同时过表达SOX4(缺失3’UTR)，发现E-cadherin表达下调，Vimentin、ZEB1、Snail1表达上调；乳腺球囊形成能力增强；CD44high/CD24low细胞亚群比例及ALDH活性增加。
5.在过表达miR-30a和敲低SOX4的细胞系中检测TGF-β通路相关分子，发现P-SMAD2/3、TGFBR1表达水平下调；而在过表达miR-30a的细胞系中同时过表达SOX4(缺失3’UTR)，miR-30a对TGF-β通路的抑制作用被逆转；对TCGA乳腺癌数据进行生物信息学分析，结果显示EMT、CSC和TGF-β通路相关分子的表达量与miR-30a的表达水平呈负相关性。
6.裸鼠移植瘤实验，发现过表达miR-30a组中肿瘤生长速度及体积明显低于对照组；免疫组化结果显示，在过表达miR-30a组中，E-cadherin表达上调，Vimentin表达下调，CSC相关分子BMI1、OCT4表达下调，SOX4表达以及TGF-β通路相关分子表达均下调。
7.TCGA数据库生存分析结果显示，miR-30a的高表达与较好的生存预后相关；免疫组化结果显示：42例临床乳腺癌病例中SOX4的阳性率达52%，133例乳腺癌组织芯片中的阳性率为56%；SOX4的阳性表达与三阴型乳腺癌呈明显的正相关性；生存分析结果显示，SOX4是乳腺癌的一个不良预后参数。
8.小分子化合物双硫仑处理细胞48小时，可以不同程度的上调miR-30a的表达水平。
【结论】
1.miR-30a在体内体外均对乳腺癌EMT和CSC表型具有抑制作用。
2.SOX4是miR-30a的靶基因，并与miR-30a之间形成双向负反馈环。
3.miR-30a抑制乳腺癌EMT和CSC的作用与靶向SOX4相关。
4.miR-30a/SOX4是通过TGF-β通路对乳腺癌EMT及CSC表型产生抑制作用。
5.miR-30a与良好的预后生存相关，而SOX4是乳腺癌的一个不良预后参数。
6.小分子化合物双硫仑可能通过上调乳腺癌细胞中miR-30a的表达，进而达到发挥miR-30a抑制肿瘤的作用。
探索miR-30a对乳腺癌上皮间质转化和干细胞样表型的影响及可能的作用机制。
【方法】
1.实时定量PCR检测miR-30a在乳腺癌细胞系与正常乳腺细胞系中的基础表达量；建立稳定过表达miR-30a的细胞系，体外实验观察miR-30a对EMT和CSC表型的抑制作用：光镜下观察细胞形态学变化；Westernblot、免疫荧光检测EMT相关分子的表达；乳腺球囊形成实验检测肿瘤细胞的自我更新能力；流式细胞术检测CD44high/CD24low细胞亚群比例及细胞内ALDH活性的变化。
2.生物信息学预测miR-30a潜在靶基因；荧光素酶报告基因实验验证SOX4是否为miR-30a的靶基因；在TCGA数据库中分析miR-30a和SOX4的表达相关性；实时定量PCR检测细胞内miR-30a和SOX4表达量的变化情况。
3.实时定量PCR检测SOX4在乳腺癌细胞系与正常乳腺细胞系中的基础表达量；建立稳定敲低SOX4的细胞系，体外实验观察下调SOX4对EMT和CSC表型的影响。
4.在过表达miR-30a的细胞中同时过表达SOX4(缺失3’UTR)，观察上调SOX4是否削弱了miR-30a对EMT和CSC表型的抑制作用。
5.Westernblot检测TGF-β通路上SMAD2/3、P-SMAD2/3、TGFBR1表达的变化；结合TCGA数据库进行生物信息学分析，进一步验证miR-30a和EMT、CSC以及TGF-β通路的关系。
6.构建乳腺癌原位移植瘤动物模型；免疫组化检测移植瘤中EMT、CSC和TGF-β信号通路相关指标的变化。
7.TCGA数据库分析miR-30a表达与生存的关系；免疫组化实验检测乳腺癌组织中SOX4的表达，分析SOX4的表达情况与临床病理参数的相关性及其对生存预后的影响。
8.实时定量PCR检测小分子化合物双硫仑能否上调乳腺癌细胞中miR-30a的表达，进而达到发挥miR-30a肿瘤抑制因子的作用。
【结果】
1.过表达miR-30a的乳腺癌细胞相较于对照组中，EMT和CSC表型均被抑制：对照组中加入TGF-β可诱导细胞发生EMT，其形态由典型的极性、鹅卵石样变为非极性、长梭形的间质细胞样，而过表达miR-30a的细胞可对抗这种由TGF-β诱导的细胞形态改变；过表达miR-30a的细胞系中E-cadherin表达上调，Vimentin、ZEB1、Snail1表达下调；乳腺球囊形成能力减弱；CD44high/CD24low细胞亚群比例降低，细胞内ALDH活性下降。
2.分析microRNA靶基因预测结果，选择SOX4作为miR-30a的靶基因；荧光素酶报告基因实验证实SOX4是miR-30a的靶基因；TCGA数据库分析发现miR-30a和SOX4的表达情况呈现明显的负相关性；实验发现，在细胞中上调SOX4表达，miR-30a表达明显下降；而敲低SOX4后，miR-30a表达明显上调，二者之间形成双向负反馈环。
3.SOX4在正常乳腺细胞系中表达明显低于乳腺癌细胞系；实验发现，敲低SOX4后细胞对TGF-β诱导的EMT形态变化有抵抗作用，且细胞中E-cadherin表达上调，Vimentin、ZEB1、Snail1表达下调；乳腺球囊形成能力下降；CD44high/CD24low细胞亚群比例降低，ALDH活性下降。
4.在过表达miR-30a的细胞中同时过表达SOX4(缺失3’UTR)，发现E-cadherin表达下调，Vimentin、ZEB1、Snail1表达上调；乳腺球囊形成能力增强；CD44high/CD24low细胞亚群比例及ALDH活性增加。
5.在过表达miR-30a和敲低SOX4的细胞系中检测TGF-β通路相关分子，发现P-SMAD2/3、TGFBR1表达水平下调；而在过表达miR-30a的细胞系中同时过表达SOX4(缺失3’UTR)，miR-30a对TGF-β通路的抑制作用被逆转；对TCGA乳腺癌数据进行生物信息学分析，结果显示EMT、CSC和TGF-β通路相关分子的表达量与miR-30a的表达水平呈负相关性。
6.裸鼠移植瘤实验，发现过表达miR-30a组中肿瘤生长速度及体积明显低于对照组；免疫组化结果显示，在过表达miR-30a组中，E-cadherin表达上调，Vimentin表达下调，CSC相关分子BMI1、OCT4表达下调，SOX4表达以及TGF-β通路相关分子表达均下调。
7.TCGA数据库生存分析结果显示，miR-30a的高表达与较好的生存预后相关；免疫组化结果显示：42例临床乳腺癌病例中SOX4的阳性率达52%，133例乳腺癌组织芯片中的阳性率为56%；SOX4的阳性表达与三阴型乳腺癌呈明显的正相关性；生存分析结果显示，SOX4是乳腺癌的一个不良预后参数。
8.小分子化合物双硫仑处理细胞48小时，可以不同程度的上调miR-30a的表达水平。
【结论】
1.miR-30a在体内体外均对乳腺癌EMT和CSC表型具有抑制作用。
2.SOX4是miR-30a的靶基因，并与miR-30a之间形成双向负反馈环。
3.miR-30a抑制乳腺癌EMT和CSC的作用与靶向SOX4相关。
4.miR-30a/SOX4是通过TGF-β通路对乳腺癌EMT及CSC表型产生抑制作用。
5.miR-30a与良好的预后生存相关，而SOX4是乳腺癌的一个不良预后参数。
6.小分子化合物双硫仑可能通过上调乳腺癌细胞中miR-30a的表达，进而达到发挥miR-30a抑制肿瘤的作用。