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小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)是从胎鼠分离的成纤维细胞,该细胞在体外为贴壁生长,形状呈大小不均的梭形或形状不规则的异形状。目前,MEF细胞在诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS)研究中的应用最为广泛,它是该技术中最早也是最常用的靶细胞之一。iPS技术将诱导转录因子Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4通过载体导入靶细胞中,重编程后诱导成为特性与功能上和胚胎干细胞极为相似的多功能干细胞。因iPS在研究中可替代胚胎组织,不涉及伦理问题,且具有自我更新、分化成多种类型的体细胞的重要功能。因此,在各医学领域都具有广阔的前景。然而,该技术仍旧存在一些亟待解决的问题,例如携带诱导转录因子的载体选择问题,如何提高诱导效率的问题,这些都将成为目前iPS的研究热点。人5型腺病毒(Adenovirus serotype5,Ad5)载体相比慢病毒载体等具有非整合性,规避了肿瘤发生的潜在风险,解决了 iPS在临床应用的安全性问题。因此,Ad5载体在iPS技术的治疗应用中具有重要意义。Ad5通过细胞表面柯萨奇受体CAR(Coxsackie and adenovirus receptor)感染靶细胞,但 MEF 细胞表面的 CAR表达量很低,因此限制了腺病毒载体在iPS技术中的应用。所以,为较好的解决这一问题,本课题试图筛选获得与MEF细胞特异性结合的外源小肽,并利用其对腺病毒的衣壳蛋白Hexon进行遗传学修饰,从而通过外源小肽的介导,提高腺病毒对靶细胞的感染效率。进而用该外源小肽遗传学修饰携带iPS诱导因子的腺病毒载体,最终达到提高iPS的诱导效率的目的。本课题将利用噬菌体展示技术,筛选获得与MEF细胞高亲和力的特异结合的小肽,并用其遗传修饰腺病毒衣壳蛋白Hexon,得到的经特异性小肽修饰的腺病毒可以高效的感染MEF细胞。同时,获得经该小肽修饰的携带iPS诱导转录因子的腺病毒载体,为提高iPS诱导效率奠定基础。本实验研究的主要内容和结果如下:(1)对小鼠胚胎成纤维细胞MEF具有特异性结合的小肽的筛选:利用Ph.D.-12噬菌体随机12肽展示文库,通过水-有机相分离原理的生物淘选和选择性作用配基快速分析方法(BRASIL)以及细胞等渗缓冲液洗涤法相结合,选取小鼠胚胎细胞NIH/3T3细胞为负筛细胞,以小鼠胚胎成纤维细胞MEF细胞为靶细胞,筛选针对MEF细胞的特异性小肽,经过四轮淘选,随机挑选23个噬菌体克隆进行DNA测序分析,经分析总共得到7个不同的小肽序列,其中两个高重复小肽MetSHEMetNVHGYRN(存在噬菌体中的小肽简称:phage MSHE,化学合成的核苷酸序列简称:MSHE)和DLWGYHYIDLDT(存在噬菌体中的小肽简称:phage DLWG,化学合成的核苷酸序列简称:DLWG);两个具有VD和YHPLKHKY的motif的小肽VDLHYHPLKHKY(存在噬菌体中的小肽简称phage VDLH,化学合成的核苷酸序列简称:VDLH)和VDIPYHPLKHKY(存在噬菌体中的小肽简称phage VDIP,化学合成的核苷酸序列简称:VDIP),其余三个噬菌体小肽只出现一次。(2)筛选所得到的含12肽噬菌体对MEF细胞的结合能力的体外检测:全细胞酶联免疫吸附实验验证 phage MSHE、phage DLWG、phage VDLH 和 phage VD IP可以与MEF细胞特异性结合,结合滴定检测实验和细胞免疫荧光染色实验结果均验证了上述四个小肽的噬菌体克隆可以特异性地结合MEF细胞。综合上述实验结果表明,上述四个小肽噬菌体克隆可以特异地与MEF细胞结合。(3)分别经GGGSMSHE、MSHE、DLWG、VDLH和VDIP小肽遗传修饰腺病毒衣壳蛋白Hexon的腺病毒载体的构建:化学合成GGGSMSHE、MSHE、DLWG、VDLH和VDIP小肽核苷酸序列,同时为验证柔性linker是否可以减少腺病毒骨架对小肽构象的影响,选取重复频率最高的小肽MSHE,在其两端加入柔性linker GGGS,命名为GGGSMSHE。利用一步连接法对腺病毒衣壳蛋白Hexon进行遗传学修饰,成功获得了 pGHMAd5-GGGSMSHE、pGHMAd5-MSHE,pGHMAd5-DLWG、pGHMAd5-VDLH和pGHMAd5-VDIP五个腺病毒载体。并经Pac I线性化后转染HEK293细胞包装产生腺病毒,经一系列的扩增后,采用氯化铯密度梯度离心方法获得高纯度的腺病毒,并测定其滴度,成功获得了Ad5-eGFP-Hexon-GGGSMSHE、Ad5-eGFP-Hexon-MSHE、Ad5-eGFP-Hexon-VDLH和 Ad5-eGFP-Hexon-VDIP 四个腺病毒。(4)衣壳蛋白经GGGSMSHE、MSHE、VDLH和VDIP小肽修饰的腺病毒对MEF细胞的感染效率的检测:纯化后的腺病毒以不同滴度感染MEF细胞和U20S细胞,感染48h后,在倒置荧光显微镜下观察报告基因绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,eGFP)的表达情况并拍照。随后,利用流式细胞技术对感染效率做定量检测。结果表明,经GGGSMSHE和VDLH修饰衣壳蛋白Hexon的腺病毒 Ad5-eGFP-Hexon-GGGSMSHE 和 Ad5-eGFP-Hexon-VDLH 可以明显提高对MEF细胞的感染效率。同时,加入柔性linker的腺病毒Ad5-eGFP-Hexon-GGGSMSHE的感染效率相较腺病毒Ad5-eGFP-Hexon-MSHE的感染效率有显著的提高。(5)分别携带Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4诱导转录因子的腺病毒通用载体的构建:采用同源重组的方法构建了 E1区分别携带Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4诱导转录因子的通用型腺病毒载体,并利用GGGSMSHE和VDLH小肽对上述通用腺病毒载体衣壳蛋白Hexon进行遗传修饰。成功获得pAd5/El-Oct4/Hexon-GGGSMSHE、pAd5/E1-Sox2/Hexon-GGGSMSHE、pAd5/E1-c-Myc/Hexon-GGGSMSHE、pAd5/E1-Klf4/Hexon-GGGSMSHE、pAd5/E1-Oct4/Hexon-VDLH、pAd5/El-Sox2/Hexon-VDLH、pAd5/El-Klf4/Hexon-VDLH、pAd5/E1-c-Myc/Hexon-VDLH。综上所述,本课题获得以下主要结果:成功利用噬菌体肽库筛选并获得了针对小鼠胚胎成纤维细胞MEF细胞的特异性结合的12肽;成功将上述小肽用于腺病毒衣壳蛋白Hexon的遗传修饰,得到的经GGGSMSHE和VDLH小肽修饰的腺病毒可以明显提高对MEF细胞的感染效率;并将该小肽用于修饰携带iPS诱导转录因子的通用型腺病毒载体中,成功获得经GGGSMSHE和VDLH小肽修饰携带iPS诱导转录因子的腺病毒载体。本课题的研究结果,为将来采用MEF为模型的体外实验研究,如采用MEF细胞诱导iPS等奠定基础。