第一章参与大鼠喉化学反射的神经元在小脑、脑干中的解剖学分布研究目的:喉化学反射效应包括声门关闭、呼吸暂停、血压升高等,是新生儿猝死综合征的主要诱因之一。胃食管返流导致食物或消化液等异物逆流进入喉腔刺激引起喉化学反射,研究证明该症状与新生儿脑干发育不全相关。喉化学反射是简单反射,其反射中枢主要位于延髓,但参与其调控的神经核团并不清楚。小脑顶核参与包括呼吸调节在内的多种生理机能反射,其是否参与喉化学反射尚未见报道。该部分研究旨在找到参与大鼠喉化学反射的延髓、小脑神经核团。方法:成年雄性SD大鼠实验组在麻醉状态下经KCl-HCl灌注喉腔诱导喉化学反射,同时记录腹部呼吸肌群灌注前后肌张力变化。对照组行与实验组相同操作但不予化学灌注。随后采用c-fos免疫荧光标记小脑、脑干中被激活神经的分布,并在荧光显微镜下统计分析,比较实验组和对照组的分布、数量差异。结果:化学刺激诱导大鼠喉化学反射,实验动物腹部呼吸肌群张力显著降低,呼吸节律明显下降并出现呼吸暂停现象。经统计学分析,延髓双侧孤束核、前庭复合核、疑核疏松结构、头端腹侧呼吸组、腹外侧网状结构、前包钦格复合核、包钦格复合核、三叉神经脊核和中缝隐核的Fos样免疫阳性神经元经喉化学反射激活,数量明显增加。实验组、对照组小脑中未发现Fos样免疫阳性神经元。结论:延髓是喉化学反射调控中枢,多个神经核参与大鼠喉化学反射调控;小脑可能不参与喉化学反射。第二章延髓儿茶酚胺能,5-羟色胺能和胆碱能神经元参与大鼠喉化学反射调控目的:儿茶酚胺能,5-羟色胺能和胆碱能神经元在延髓广泛分布。我们过去的研究显示喉运动神经元接受儿茶酚胺能和5-羟色胺能神经元投射,而所有喉运动神经元本身均表现胆碱能神经元特性。病理学研究强调中枢神经系统儿茶酚胺能和5-羟色胺能通路异常是新生儿猝死综合征的主要诱因。因此我们有理由推测延髓儿茶酚胺能、5-羟色胺能和胆碱能神经元参与调控喉化学反射,该部分研究目的是发现这三种递质能神经元经喉化学反射诱导激活后在延髓的分布情况。方法:本实验中,实验组成年SD大鼠采用KCl-HCl喉腔灌流诱导麻醉状态下喉化学反射。对照组行同样操作但不诱导喉化学反射。通过延髓切片免疫组织化学分析,fos样免疫阳性分别与酪氨酸羟化酶免疫阳性、5-羟色胺免疫阳性以及胆碱囊泡转运体免疫阳性共同标记,分别指征经喉化学反射诱导激活的儿茶酚胺能、5-羟色胺能和胆碱能神经元。随后在荧光显微镜下观察经喉化学反射激活的三种递质能神经元在实验组、对照组中的分布情况。结果:实验组中,疑核疏松结构中观察到c-fos-胆碱囊泡转运体免疫阳性双标神经元;延髓背外侧孤束核中12.71%的fos样免疫阳性神经元同时显示酪氨酸羟化酶免疫阳性(儿茶酚胺能),中缝隐核中70.87%的FLI神经元为5-羟色胺能神经元。对照组延髓切片中并无找到上述免疫阳性双标神经元。结论:大鼠延髓疑核疏松结构内胆碱能喉运动神经元、背外侧孤束核中部分儿茶酚胺能神经元和中缝隐核大部分5-羟色胺能神经元均参与调控喉化学反射。实验结果暗示该部分神经元功能失调可能是引起新生儿猝死综合征的原因。第三章小脑顶核调控小鼠眨眼条件反射的行为学研究目的:眨眼条件反射是常用于研究联想性学习神经机制的巴浦洛夫条件反射之一。来自脑桥的苔状纤维和延髓下橄榄核的攀缘纤维分别将条件刺激和非条件刺激传入小脑皮层和小脑深部核团,经小脑整合并传出信息,引发眨眼条件反射和非条件反射。以往研究表明小脑深部核团是参与眨眼条件反射的重要单元,长期损毁未训小鼠小脑深部核团导致其学习障碍,或致使训后小鼠眨眼条件反射消失。尚无报道显示短期或在条件刺激期间暂时阻断顶核对小鼠眨眼条件反射影响如何。顶核是小脑进化过程中最先出现的深部核团,参与多种生理功能及反射,其在眨眼条件反射中的作用至今未知。该部分研究目的是:1.探究顶核是否参与小鼠眨眼条件反射;2.研究在学习期间阻断顶核,对未训小鼠学习过程的影响;3.观察短期或条件刺激期间暂时阻断顶核,训后小鼠眨眼条件反射的行为学变化。方法:1.观察、记录并比较此采用蝇蕈醇至成年C57BL/6训后小鼠顶核微量注射前,注射后5min和注射后一天的眨眼条件反射行为学变化。2.采用designed receptor exclusively activated by designed drugs(DREADD)系统实现短时间阻断顶核或间位核。第1-10天给予成年C57BL/6未训小鼠每天学习前腹腔注射氯氮平-N-氧化物激活DREADD系统,随后进行眨眼条件反射学习训练;第11-17天终断氯氮平-N-氧化物给药,训练至实验动物形成良好条件反射;第18-19天恢复氯氮平-N-氧化物注射,观察小鼠眨眼条件反射行为学变化。3.采用光遗传学技术激活成年训后L7cre/Ai27小鼠浦肯野细胞轴突末梢,从而抑制顶核神经元活动。观察在条件刺激全段(0-250 ms)、前半段(0-125 ms)和后半段(125-250 ms)抑制顶核时小鼠眨眼条件反射行为学变化。结果:1.与微量注射蝇蕈醇前相比,注射至顶核5min后条件反射消失;注射后一天条件反射试验数量占总试验百分比、条件闭眼幅度与注射前相比无显著差异。2.与对照组相比,顶核、间位核DREADD组同样可以习得并表达条件反射,但所表达的条件反射幅度显著低于对照组。3.光遗传学手段于条件刺激0-125 ms,125-250 ms,0-250 ms抑制顶核均可显著降低条件闭眼幅度,但条件反射试验数量占总试验百分比与非光遗传刺激条件反射相比无显著差异。结论:小脑顶核参与小鼠眨眼条件反射,阻断其可导致未训小鼠建立条件反射延迟,但是否影响训后小鼠条件反射还有待研究。第四章小鼠眨眼条件反射过程中间位核、顶核神经元体内电生理学研究目的:电生理学研究结合巴浦洛夫反射揭示了小脑运动性学习的神经机制。眨眼条件反射过程中小脑皮层神经元电生理活动已被前人阐述。作为小脑传出神经元所在的唯一区域,小脑深部核团在眨眼条件反射中扮演信息整合、转换和传出的重要作用,但其电生理学放电模式至今未见报道。顶核内包含多种类型神经元,伽马氨基丁酸能神经元在眨眼条件反射中的电生理调控模式有待研究。小脑间位核、顶核调控眨眼条件反射的传出神经通路不同,二者是否有共同脑干传入通路还不清楚。该部分研究的目的是:1.研究小脑间位核、顶核神经元在小鼠眨眼条件反射过程中的放电模式;2.光遗传学技术标记顶核伽马氨基丁酸能神经元,并探究该类神经元在眨眼条件反射中的电生理学特征;3.利用逆向神经示踪技术研究在眨眼条件反射中顶核、间位核的共同传入神经元。方法:所有小鼠经眨眼条件反射方案训练至形成稳定、良好的条件反射。1.形采用细胞外电生理技术记录小脑顶核、间位核在成年C57BL/6小鼠眨眼条件反射过程中的放电过程,并用摄像机记录小鼠眼睑对条件刺激和非条件刺激的反应。在电生理记录最后一天记录结束后,采用玻璃电极微量注射霍乱毒素B亚单位以标记记录区域。2.于成年Gad2-cre小鼠顶核微量注射hSyn1-AAV-flex-chrimson-tdtomato并在同一钻孔处植入长2 mm光纤。病毒三周充分表达后,细胞外电生理记录对在体光刺激有反应的顶核神经元,随后测试该类神经元在眨眼条件反射试验中的放电模式。结果:1.采用体内电生理总共记录42个顶核神经元,其中25个(60%)神经元在条件反射期间表现神经冲动易化,其余表现冲动抑制;6个(14%)顶核神经元放电频率与条件反射性眼睑闭合幅度相关。总共记录270个间位核神经元,其中部分(30%)神经元表现冲动易化;20个(7.4%)间位核神经元放电频率与条件反射性眼睑闭合幅度相关。2.总共在Gad2-cre小鼠顶核记录到31个对在体光刺激有反应的细胞,其中10个细胞在体内光刺激区间放电频率增高(伽马氨基丁酸能神经元),该类细胞对条件刺激无调制效应;其余21个细胞在体内光刺激区间放电频率降低(受局部抑的制神经元),该类细胞对条件刺激的调制效应均为冲动易化。结论:1.小脑顶核、间位核神经元在条件眨眼反射过程中表现多种调制效应,调控反射的开始、进行和结束;部分神经元放电频率与眼睑闭合幅度相关,暗示该部分神经元在眨眼条件反射中调节眼睑运动,可能是运动性学习记忆的重要参与部分。2.顶核伽马氨基丁酸能神经元可能不参与条件眨眼反射;顶核内受局部抑制的神经元参与调控眨眼条件反射。