论文部分内容阅读
本实验室的前期的研究中，证明苯并噻二唑(benzothiadiazole，BTH)能诱导水稻对稻瘟病、白叶枯病和纹枯病等病害的抗病性，并运用抑制性差减杂交法鉴定了200多个与水稻抗病反应相关的差异表达cDNA克隆，其中的一个克隆HIHN-w5可能含有编码homeodomain蛋白转录因子的基因片段。在此基础上，本研究克隆鉴定了水稻中与苯并噻二唑诱导抗病性相关的编码homeodomain型BELL转录因子基因OsBIHD1(GenBank登录号：AY524972)，并对其功能做了进一步的分析。 在水稻抗病反应相关的差异表达的cDNA中，克隆HIHN-w5含有733 bp的插入片段，通过在GenBank数据库中的序列相似性搜索发现，该插入片段与Arabidopsis thaliana中homedomain型转录因子BELL1和番茄中homedomain型转录因子BELL30基因具有高度的相似性。运用改良的快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术，以水稻cDNA文库噬菌体DNA为模板，扩增出5’-末端的缺失序列并以此为基础获得基因全长，命名为OsBIHD1。结果表明该基因全长cDNA约为2524 bp，其中包含1929 bp的ORF、257 bp的5’-UTR和339 bp的3’-UTR。该基因编码一个含642个氨基酸的蛋白，含有BELL型homedomain蛋白所有的特征性保守结构域。基因结构分析表明OsBIHD1基因位于水稻第三染色体上，包括了4个外显子和3个内含子，在水稻基因组中以单拷贝的形式存在。将OsBIHD1的编码区ORF克隆进原核表达载体，纯化获得重组的OsBIHD1融合蛋白。进行的凝胶阻滞实验结果表明，重组OsBIHD1融合蛋白能够结合homeodomain型转录因子的顺式作用元件DNA序列。同时将OsBIHD1的编码区ORF与绿色荧光蛋白基因构建成融合载体进行OsBIHD1蛋白的亚细胞定位，发现OsBIHD1蛋白存在于细胞核内。由此我们认为OsBIHD1是一种BELL型的homeodomain蛋白。 为了研究OsBIHD1基因在水稻抗病性中的作用，我们对OsBIHD1基因在水稻诱导抗病性以及在水稻—稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)亲和与非亲和互作中的表达模式进行了分析。Northem分析结果表明，虽然OsB祛心I基因在水稻植株体内有一定水平的基础表达，但在BTH处理后OsB月叹Dl基因迅速被激活表达，而且在水稻幼苗与M grisea非亲和性互作中‘坛刀刀叹。]基因在接种后6h时就快速激活表达，而在水处理和与Mgrl’sea亲和性互作的感病品种水稻幼苗中几乎检测不到OsB祛田了的诱导表达。这些结果表明，OsB刀叹Dl基因的表达与水稻的抗性反应和(或)水稻和病原菌的非亲和互作有关。 为了进一步明确水稻OsBIHDI基因在抗病性中的作用，我们利用外源花椰菜花叶病毒组成型强表达启动子CaMv35s与载体系统CHF3ppZP212构建水稻osBll石D了基因的植物转化双元表达载体，通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefacl’ens)介导的叶盘法转化法将。‘刀祛田I基因转化烟草，Kan十抗性和PCR筛选获得21株转OsB肠心I基因TO代烟草植株。Southem分析表明乙坛刀祛田I基因已整合到烟草基因组DNA中。Northem分析结果表明所检测的〔坛刀刀笙Dl转基因烟草TO代植株大部分能够正常表达产生OsB乃心I基因的RNA。过量表达〔坛刀祛田I基因的转基因植株中PR一了基因有组成型增强表达，说明口￡几伪哟了基因参与了烟草植株防卫反应的激活过程。抗病性测定表明，这些转基因植株对烟草黑胫病菌(尸彻t叩人thora夕arasitica var. nicotl.anae)、烟草花叶病毒(TMv)和番茄花叶病毒(ToMV)的抗病性明显提高。结合OsB肠心I基因在水稻抗病反应中的诱导表达情况，我们认为OsBIHDI在激活水稻抗病反应的信号途径中起作用。同时我们也发现，转基因小苗的顶芽和根系表现异常，一些转基因株系的繁殖能力下降或不育。因此认为，osBIHDI蛋白具有调控植物生长发育和调控防卫反应基因表达的双重作用。本研究进一步对转基因植株进行抗盐和抗氧化胁迫生物测定，初步结果表明，转OsB乃心了基因植株对高盐和氧化胁迫敏感，推测OsBI万D了基因可能与植物的多种抗逆性有关。