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小反刍兽疫（Peste des petits ruminants,PPR）俗称羊瘟,是由副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属（Morbolivirus）的小反刍兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants virus,PPRV）引起山羊、绵羊等小反刍动物的一种急性病毒性传染病。该病以急性胃炎、支气管肺炎、肠炎和怀孕母羊流产为主要特征。目前,该病在许多国家已经成为一种地方性流行疫病,直接制约着养羊业发展。PPRV对感染宿主的淋巴细胞和上皮细胞具有较强噬性,其感染宿主后造成机体免疫抑制是其致病的主要特征。外泌体（exosomes）是真核细胞在病理和生理条件下均会分泌的一种膜性微小囊泡,其通过旁分泌和生物体循环系统到达周围靶细胞或远程靶细胞,将生物信息传递至靶细胞。近年研究表明,外泌体介导的病毒逃逸或抑制宿主免疫系统可能是病毒致病的一条关键途径。病毒感染宿主细胞后可诱导其分泌大量含有病毒源RNA或/和细胞源RNA以及其它蛋白质的外泌体,这些外泌体可随血液循环等传递至附近或远程细胞,顺序调控这些吸纳细胞中基因表达水平。外周血单个核细胞（PBMCs）在病原识别和早期先天免疫应答启动中发挥着重要作用,山羊PBMCs是研究PPRV和感染宿主相互作用的主要细胞模型。我们的前期研究证明,PPRV感染引起山羊PBMCs外泌体释放水平上升,提示外泌体参与PPRV对山羊致病中的作用。本研究旨在探明PPRV感染山羊PBMCs源外泌体荷载物组成及外泌体进入山羊母-胎细胞途径,进一步研究PPRV感染PBMCs源外泌体与吸纳细胞共培养后,对细胞中免疫相关因子表达水平的影响。研究内容如下:1.PPRV感染山羊PBMCs源外泌体组分分析。通过深度测序技术和液相色谱串联质谱技术对PPRV感染山羊PBMCs源外泌体组分进行了分析,结果表明:mi RNA表达谱相较于未感染对照组外泌体发生显著变化,其中31种mi RNA表达水平显著上调,290种mi RNA的表达水平显著下调,KEGG分析表明,显著富集的通路包括代谢通路（ko01100）、癌症通路（ko05200）、PI3K-AKT信号通路（ko04151）、内吞作用（ko04144）、MAPK信号通路（ko04010）、Ras信号通路（ko04014）,Rap1信号通路（ko04015）、粘着斑（ko04510）、肌动蛋白细胞骨架调节（ko04810）、c AMP信号通路（ko04024）;蛋白质表达谱分析表明,感染组外泌体较未感染对照组外泌体有118种蛋白表达上调、33种蛋白表达下调。KEGG分析显示,共18条显著富集的信号通路途径,其中富集最显著的6条通路包括Th17细胞分化（chx04659）、Th1和Th2细胞分化（chx04658）、内质网蛋白加工（chx04141）、雌激素信号通路（chx04915）、IL-17信号通路（chx04657）、坏死性下垂（chx04217）。此外,基于蛋白组组学分析和Western blot检测分析表明,PPRV感染PBMCs源外泌体中荷载高水平的PPRV H蛋白、N蛋白和V蛋白。2.外泌体进入山羊母-胎细胞途径分析。为确定外泌体进入山羊细胞的途径,本研究用PKH-26标记山羊PBMCs源外泌体并检测其与山羊母-胎细胞共培养不同时间（0h、6 h、12 h、24 h、48 h）的进入情况。激光共聚焦检测结果表明,外泌体均可进入山羊PBMCs、山羊子宫内膜上皮细胞（EECs）和山羊胎儿成纤维细胞（GEFs）;为了进一步研究外泌体进入细胞的具体途径,我们将不同细胞用相关进入途径阻断药物预处理后,通过激光共聚焦和流式细胞术检测PBMCs源外泌体进入山羊PBMCs、EECs和GEFs的途径,结果表明:外泌体进入PBMCs主要通小窝蛋白和网格蛋白介导的内吞途径;外泌体进入EECs主要通过小窝蛋白和网格蛋白介导的内吞途径和动力蛋白依赖的进入途径,同时也受PPRV受体蛋白Nectin-4的显著影响;外泌体进入GEFs主要通过小窝蛋白介导的内吞途径和动力蛋白依赖的进入途径;外泌体进入PBMCs、EECs、GEFs均伴有PI3K参与的巨胞饮作用的调节。3.外泌体对吸纳细胞中免疫相关因子表达水平的影响。为确定PPRV感染源外泌体对山羊细胞中免疫相关细胞因子表达的影响,提取PPRV感染山羊PBMCs源外泌体后与PBMCs共培养。通过q PCR和Western blot检测,结果表明:感染源外泌体共培养山羊PBMCs中IFN-γ、TNF-α、IL-10表达水平上升,IFN-α表达水平下降。结合本实验室前期研究PPRV H蛋白具有促进SLAM表达,以及SLAM在调节细胞因子表达中的作用,进一步检测了PPRV感染源外泌体对山羊PBMCs中SLAM表达影响,结果表明:PPRV感染细胞源外泌体荷载高水平的病毒H蛋白可引起山羊PBMCs中SLAM表达水平显著提高;此外,PPRV感染PBMCs源外泌体还可引起EECs和GEFs中炎性因子IL-4、IL-8、IL-10和TNF-α表达水平升高,IFN-β表达水平降低。综上所述,PPRV感染山羊PBMCs源外泌体中mi RNA和蛋白表达谱均较未感染细胞源外泌体发生显著变化,且含有高水平的PPRV N蛋白、H蛋白和V蛋白;外泌体可以通过多种途径进入山羊不同类型细胞,且影响吸纳细胞中免疫相关细胞因子的表达水平。本研究为进一步探究外泌体参与PPRV造成感染山羊免疫抑制奠定了基础,特别为深入研究PPRV造成怀孕母羊发生流产等致病机制研究提供了新的思路。