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第一部分复制缺陷型腺病毒介导IL-24对肝癌裸鼠的促凋亡作用目的：用复制缺陷型腺病毒介导的IL-24基因(Interleukin-24)治疗肝癌裸鼠移植瘤,探索基因治疗用于肝癌的新方法。方法：构建携带人IL-24/mda-7基因的非复制性腺病毒载体(Ad.mda-7)及裸鼠肝癌模型,1周后当裸鼠肿瘤生长直径约为5～6mm时,计为第0天,将裸鼠随机分为3组,每组8只。(1)空白对照组：肝癌裸鼠模型的腹腔内注射生理盐水0.3ml,1/d,共3次。(2)阴性对照组(Ad.vec组)：Ad.vec肿瘤内局部多点注射,每只裸鼠共注入3×1010vp。(3)基因治疗组(Ad.mda-7组)：Ad.mda-7肿瘤内局部多点注射,每只裸鼠共注入3×1010vp。共计3个实验组对肝癌细胞裸鼠移植瘤进行治疗,观察各组裸鼠生存时间及肿瘤体积的变化,并对各组瘤体组织进行TUNEL检测。结果：成功构建了非复制性腺病毒mda-7/IL-24载体并能实现体内表达,基因治疗组(Ad.mda-7)裸鼠平均生存时间为61.4±1.67d,与其它2组相比生存期明显延长(P<0.01)；基因治疗组(Ad.mda-7)治疗后36d的抑癌率为45.96%,显著高于阴性对照组(Ad.vec)的11.63%(P<0.01)；基因治疗组(Ad.mda-7)肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡指数为25.7%±3.1%,与另两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论：复制缺陷型腺病毒介导mda-7/IL-24对肝癌裸鼠模型具有明显的抗肿瘤作用,其主要作用机制与mda-7/IL-24促进肿瘤组织中肝癌细胞凋亡有关。第二部分重组人IL-24细胞因子对肝癌细胞株的选择性抗肿瘤作用目的：观察重组人mda-7/IL-24细胞因子(rhIL-24)对肝癌细胞株HepG2的生物学作用,为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法：将重组人mda-7/IL-24细胞因子(rhIL-24)干预正常肝细胞株L02、肝癌细胞株HepG2和人肺癌细胞株A549。通过RT-PCR方法观察各细胞株膜表面IL-24细胞因子受体链(IL-20R1/IL-20R2和IL-22R/IL-20R2)的表达状态,采用四甲基偶氮唑蓝染色法(MTT)观察rhIL-24对肝癌细胞的生长抑制和杀伤作用,荧光染料CFSE检测rhIL-24对肝癌细胞及正常肝细胞增殖的影响,再用Annexin-V和PI双染后流式细胞仪检测rhIL-24对肝癌细胞的凋亡诱导作用,以及利用PI单染法流式细胞仪检测rhIL-24对细胞周期的影响。结果：(1)RT-PCR检测表明正常肝细胞L-02膜表面IL-20R1(+)IL-20R2(+)IL-22R1(+),肝癌细胞系HepG2膜表面IL-20R1(-)IL-20R2(+)IL-22R1(+)；(2)160nmol/L rhIL-24能促进正常肝细胞L-02增殖(P<0.05),且随着浓度增加,细胞增殖速度也增加(P<0.05)；却可以抑制肝癌细胞的增殖,差异具有统计学意义(P<0.01); (3)CFSE法测定细胞增殖的实验发现160noml/L rhIL-24干预肝癌细胞HepG2后主要起到阻滞细胞增殖的作用,而对正常肝细胞则能起到促进细胞增殖的作用,与相应对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；(4)高浓度rhIL-24能使正常肝细胞和肝癌细胞阻滞于G0/G1期,且显著降低细胞中S期的比例；(5)160nmol/L rhIL-24干预各细胞系48h后,经流式细胞仪检测发现HepG2组细胞凋亡率显著上升,与L-02组相比差异具有统计学意义(P<0.01)；而L-02组细胞凋亡率则没有显著变化(P>0.05)。结论：人MDA-7/IL-24蛋白具有强大的旁观者效应,高浓度rhIL-24细胞因子可以诱导肝癌细胞凋亡,达到有效的抗肿瘤效果。第三部分JAK/STAT通路协同SOCS3对重组人IL-24选择性抗肿瘤作用的调控目的：探讨重组人mda-7/IL-24细胞因子(rhIL-24)对肝癌细胞株HepG2的旁观者效应机制,并深入研究rhIL-24特异性作用于肝癌细胞的选择性机理。方法：用高浓度重组人mda-7/IL-24细胞因子(rhIL-24)干预正常肝细胞株L02和肝癌细胞株HepG2。通过western-blot蛋白印迹检测rhIL-24干预后,正常肝细胞和肝癌细胞内不同时间点总STAT1、总STAT3、磷酸化STAT1、磷酸化STAT3以及JAK/STAT信号通路下游信号分子Bax、caspase-3、P53蛋白的表达变化,同时通过RT-PCR方法观察各细胞株在rhIL-24处理后,SOCS家族mRNA表达变化。之后,设计相应的化学修饰siRNA干预SOCS家族表达最强者,再用Annexin-V和PI双染后流式细胞仪检测siRNA干预后rhIL-24对正常肝细胞和肝癌细胞的作用。结果：(1) rhIL-24干预后,正常肝细胞和肝癌细胞内不同时间点总STAT1或是总STAT3的含量并无显著性差异(P>0.05), pSTAT1在正常肝细胞或是肝癌细胞中被激活,且含量较pSTAT3的含量稍低,但差异无显著统计学意义(P>0.05)；(2)高浓度rhIL-24处理后的正常肝细胞中Bax和caspase-3蛋白的表达随时间的延长而逐渐下降(P<0.05),但P53蛋白的表达不断增加(P<0.05)；而在肝癌细胞中Bax和·caspase-3蛋白的表达则随着干预时间的推移,表达量不断增加(P<0.05),但是P53蛋白的表达量则同样呈上升趋势(P<0.05); (3) 160nmol/L rhIL-24干预后,肝癌细胞HepG2中几乎没有SOCS1, SOCS3, CIS mRNA的表达,但在正常肝细胞L-02中却可以检测到少量的SOCS1 mRNA表达,以及显著的SOCS3 mRNA的表达；(4)当siRNA-SOCS3干预8h后,不仅HepG2组凋亡细胞的比例显著增加(P<0.01),更重要的是,L-02细胞也发生了大量细胞凋亡的现象,总凋亡比例从4.35%增加到35.26%,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。结论：SOCS3可能通过抑制已经激活的JAK/STAT信号通路,从而保护正常肝细胞免于高浓度rhIL-24对细胞的凋亡诱导作用,进而使得rhIL-24具有显著的选择性旁观者抗肿瘤效应。