论文部分内容阅读
[目的]上世纪90年代初发现的水通道蛋白家族是近年来的研究热点，它的发现成为人们了解水分子在细胞中的转运机制的新里程碑。而水通道蛋白2（AQP2）是迄今为止发现的最具病理生理意义的水通道蛋白之一，是维持机体水平衡调节的必需物质。AQP2主要分布在肾脏集合管主细胞胞浆内和管腔侧细胞膜上，在机体内主要受抗利尿激素（血管加压素，AVP）经血管加压素2型受体（V2R）调节，对尿液的重吸收起着较大作用。其中部分肾脏AQP2蛋白可脱落于肾小管腔内而被尿液冲出，尿液AQP2是反映AVP作用的内在生物学指标。在许多伴有水代谢失衡的疾病中，如充血性心力衰竭、肝硬化、肾病综合症等，往往存在有AQP2的表达异常，因此寻找一些能干预AOP2基因表达的药物具有较为重大的意义。利尿剂在临床上被广泛运用，尤其是在充血性心力衰竭的治疗中取得显著的疗效，虽然目前的研究中有一些关于利尿剂对于尿液AQP2的影响，但是对于肾脏AQP2基因及蛋白的改变却知之较少。本实验就正常生理情况下，常用利尿剂对大鼠肾脏AQP2基因和尿液中AQP2的改变进行了研究。另外目前西药对于AQP2的影响研究国内外均有报道，而中药方面的研究较少。而中药是我国一个宝贵资源，在某些临床疾病治疗中使用中药可以起到较好的效果。我们根据已有中药的相关信息，选取几味渗水利湿中草药作用于实验大鼠，观察灌药侯检测其对肾脏及尿液AQP2的影响，试图筛选出一至两种能干预AQP2表达的中药或者单体。[方法]人工合成AQP2蛋白C末端的CELHSPQSLPRGSKA多肽片段，并与牛血清白蛋白偶联作为标准品，将AQP2多肽与钥孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）相连后免疫家兔，获得兔抗鼠AQP2多克隆抗体。所有大鼠均单独饲养在代谢笼中，自由进食，收集尿液。实验一，对正常大鼠分别应用呋塞米（20mg／d·kg）和双氢克尿噻（25mg／d·kg）和安体舒通（20mg/d·kg），经胃灌入，大鼠自由进水，连续收集尿液，记录尿量，用间接ELISA检测尿液AQP2的变化、对用药后7天的大鼠肾内髓质分别用RT-PCR和免疫印迹法（Western blotting）检测V2R及AQP2 mRNA和AQP2蛋白。实验二，从常用的渗水利湿药物中选取常用且利尿效果明显的中药做为初筛对象，连续灌胃7天，大鼠自由进水，连续收集尿液，记录尿量，用间接ELISA法检测尿液AQP2的变化；实验三，对初筛过程中尿液AQP2有改变意义的茯苓，猪苓两种药物延长灌药时间至15天，对用药后15天的大鼠肾内髓质分别用RT-PCR和免疫印迹法（Western blotting）检测V2R及AQP2 mRNA和AQP2蛋白。[结果]一、呋塞米、双氢克尿噻及安体舒通对正常大鼠血钠、尿量、尿渗量用药7天呋塞米组、双氢克尿噻组和安体舒通组与对照组相比，血钠无显著差异。呋塞米组、双氢克尿噻组和安体舒通组大鼠尿量均显著增加有统计学意义（P＜0.001）；呋噻米组在用药后第4天达尿量峰值。用药后，呋噻米组和双氢克尿噻组尿渗量改变有显著性统计学差异（P＜0.001），呋噻米组尿渗量降低，双氢克尿噻组尿渗量升高，安体舒通组尿渗量无显著统计学差异。二、呋塞米、双氢克尿噻及安体舒通对正常大鼠尿液AQP2浓度和排泄率的影响正常组大鼠用药前后尿液AQP2浓度无显著差异，应用三种利尿药后尿液AQP2浓度均有显著增加（P＜0.001）。但三组之间无显著统计学差异；三组药物均引起尿液中AQP2的排泄率显著增加（P＜0.001），呋噻米强于双氢克尿噻和安体舒通。三、呋塞米、双氢克尿噻和安体舒通对正常大鼠肾内髓质中AQP2及V2R mRNA和AQP2蛋白的影响用药后7天，呋塞米组、双氢克尿噻组、安体舒通组的AQP2／β—actin mRNA光密度值和AQP2蛋白与对照组相比，呋塞米组AQP2 mRNA和蛋白显著升高（P＜0.001）；双氢克尿噻组AQP2 mRNA和蛋白显著减少（P＜0.001）；安体舒通组AQP2 mRNA和蛋白则无显著统计学差异。呋塞米组、安体舒通组和双氢克尿噻组肾内髓质中V2-R／β-actin mRNA光密度值与对照组比较，呋塞米组V2-R mRNA显著提高（P＜0.001），双氢克尿噻组V2-R mRNA显著减少（P＜0.001），安体舒通组则无显著改变。四、几种中药用药7天对正常大鼠尿量和尿液AQP2浓度的影响在选用的八种中药中，提气类中药人参、党参、当归尿量和AQP2浓度改变无显著统计学差异，而泽泻和葶苈子组虽然尿量有所增加，但无显著统计学差异（P＞0.05），而用药前后尿液AQP2浓度无差异。茯苓组和猪苓组尿量的增加具有显著统计学差异（P＜0.001），尿液中AQP2浓度降低有显著统计学差异。五、猪苓、茯苓用药15天对正常大鼠血钠、尿量和尿渗量的影响用药15天后，猪苓组、茯苓组和对照组相比，血钠无显著差异。尿量增加有显著性差异（P＜0.001），并随时间延长尿量增加明显，尿渗量降低有显著性差异（P＜0.001），六、猪苓、茯苓用药15天对正常大鼠尿液AQP2的影响猪苓组和茯苓组在用药前5天左右尿液AQP2浓度呈显著下降趋势，其后AQP2浓度有所回升，至用药15天与用药前比较无显著统计学差异；而猪苓组AQP2排泄率在用药后第5天减少有统计学意义，其后有所回升，至用药第9天左右开始有显著性统计学差异（P=0.037）。茯苓组在用药后第5天引起AQP2排泄率减少有显著统计学差异，其后排泄率有所回升，至第9天左右有显著性统计学差异，猪苓组引起AQP2排泄增加的效果强于茯苓组。七、猪苓、茯苓对正常大鼠肾内髓质中AQP2及V2-R mRNA和AQP2蛋白的影响用药后15天，猪苓组、茯苓组、AQP2／β-actin mRNA和AQP2蛋白光密度值与对照组相比存在显著统计学差异（F=121.642，P=0.001），猪苓组和茯苓组AQP2 mRNA均显著降低（P＜0.001），且猪苓改变比茯苓明显（P＜0.001），而V2-R／β-actin mRNA与对照组比较均减少有显著统计学差异，但两者之间无统计学差异（P＞0.05）。[结论]一、常用利尿剂呋塞米、双氢克尿噻和安体舒通都能增加正常大鼠尿量，引起尿液中AQP2排泄的增加，但呋塞米降低尿渗量、增加肾脏AQP2和V2-R的表达，同时增加肾脏AQP2蛋白表达；双氢克尿噻则升高尿渗量，减少肾脏AQP2和V2-R mRNA的表达；安体舒通引起肾脏AQP2基因表达改变不明显。二、选用的八种中药中，茯苓和猪苓均引起正常大鼠尿量增加和尿渗量的降低，并在用药早期降低尿液中AQP2排泄，但随着用药时间的延长，尿液中AQP2的排泄增加；并降低肾脏AQP2和V2-R mRNA的表达，引起AQP2蛋白表达减少。对AQP2mRNA和蛋白的作用，猪苓强于茯苓，对V2-R mRNA的作用两者之间无差异。