温度调控下大豆蛋白—酪蛋白类蛋白反应及特征表征

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本研究以大豆蛋白和酪蛋白为原料,采用α-糜蛋白酶催化类蛋白反应向大豆多肽(SP)中导入酪蛋白非磷酸肽(CNPP)形成大豆蛋白-酪蛋白复合物(CNPSPC)。运用人工神经网络方法对CNPSPC制备工艺参数进行优化,并推导出合成类蛋白动力学方程。对不同温度调控下制备得到的CNPSPC的氨基酸组成,结构表征,功能性质和营养特性进行分析。(1)采用人工神经网络对大豆蛋白-酪蛋白类蛋白反应的工艺参数进行优化,建立了反应条件同CNPSPC得率的人工神经网络模型。研究结果表明:在底物添加量比例4:1(CNPP:SP,w:w)时,反应温度为46.2℃,反应pH为4.97,反应时间20h时,CNPSPC的得率达到最大可达87.0± 0.10%。(2)采用动态光散射对类蛋白反应不同时间段聚集过程变化进行测定。得出合成的表观动力学方程。(3)通过巯基和羰基含量,SDS-PAGE电泳,拉曼光谱,荧光光谱,圆二色谱,红外光谱,扫描电镜及原子力显微镜等分析方法对类蛋白反应前后的CNPP,SP和CNPSPC的二级结构和微观形貌进行表征。电泳表明:与SP和CNPP相比,CNPSPC的分子量出现新的条带即新的聚集肽生成,并随着温度增加,CNPSPC中聚集肽的含量呈现降低趋势,CNPSPC的游离疏基的含量呈现下降的趋势。拉曼光谱表明:CNPSPC中α-螺旋含量,β-转角和无规则卷曲含量均呈先轻微降低再显著升高的变化趋势,且在40℃时达到最低,分别为7.1%,9.3%和0.1%;同时,β-折叠含量随着反应温度的增加而呈先显著增加后轻微降低的趋势,且在40℃时含量达到最大值为83.5%;红外光谱表明酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅲ带在数值上对CNPSPC的二级结构定量表现出差异性,即随着温度的增大,β-折叠含量呈现先增加趋势。圆二色谱也表明CNPSPC其β-折叠含量,α-螺旋含量降低,表现出更强的表面疏水性。因此,圆二色谱,拉曼光谱和红外光谱结果发现CNPSPC的β-折叠结构改变化在反应中占据主要作用。荧光光谱结果表明:在20℃~40℃时,最大发射波长从349.4nm减少到348nm,在40℃~60℃条件下,荧光强度急剧上升,最大发射波长由348nm增加到349.4nm。扫描电镜和原子力显微镜观测出CNPSPC的形貌及尺寸均发生变化。疏水相互作用在SP同CNNPP的结合中起到了至关重要的作用。(4)本实验对CNPP,SP和CNPSPC的氨基酸组成含量,抗氧化性,消化吸收情况,功能和营养特性进行分析。试验结果表明:与SP和CNPP相比,CNPSPC具有较好的功能性质,而温度对CNPSPC的功能性质有显著性影响,CNPSPC在50℃时表现出较好的溶解度和起泡性。与CNPP和SP相比,CNPSPC的功能特性和总氨基酸含量明显上升。CNPSPC的羟自由基清除能力,还原能力,DPPH清除能力都有所提高,而超氧自由基清除能力反而降低。通过体外消化实验的研究,无论是在胃部还是小肠内,合成温度越高,CNPSPC的体外消化率越大。
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