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目的:
内皮细胞是所有心血管危险因素共同的靶点,参与多种疾病的发生发展过程,动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)各个阶段均伴有血管内皮功能障碍。血管内皮细胞能够合成及分泌组织型纤溶酶原激活物(tissu eplasminogen activator,t-PA)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1),是体内纤溶系统的重要组成部分。T-PA与PAI-1的动态平衡对维持血浆纤溶系统的稳态和纤溶系统与凝血系统的平衡起决定性作用。当动脉粥样硬化时,引起广泛的血管内皮细胞损伤,受损伤的血管内皮细胞合成t-PA能力减低,使血浆中PAI-1水平增高,过量的PAI-1与t-PA结合,使t-PA灭活,造成体内纤溶活性降低,从而引发血栓的形成。
普罗布考(Probucol,又名丙丁酚)是一种抗氧化剂,具有调脂、抗氧化、稳定AS斑块、改善内皮功能等作用,西洛他唑(Cilostazol)是一种新型抗血小板聚集药物,临床主要用于改善慢性动脉闭塞症引起的缺血性症状如溃疡、肢痛、发冷及间歇性跛行等。两药在抗动脉粥样硬化、防治血管形成术后再狭窄等心血管疾病的治疗方面已经越来越引起人们的广泛关注。
本实验从细胞微环境角度来探讨普罗布考和西洛他唑对血管内皮细胞t-PA与PAI-1的影响,进一步明确普罗布考与西洛他唑的抗动脉粥样硬化作用机制,以及两药联合应用的协同效应。
材料与方法:
一、人脐静脉内皮细胞的培养与传代
人脐静脉内皮细胞(HUVECs)购自中国科学院上海细胞库,用含10%优质胎牛血清的DMEM培养基培养,37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱孵育,每日换液一次,2-3日传代一次,用0.125%的胰蛋白酶消化细胞。
二、大鼠肾脏微血管内皮细胞的分离培养与鉴定
3-8天龄SD胎大鼠购自中国医科大学实验动物部。梯度筛网法收集肾血管球,反复贴壁法纯化提取鼠肾脏微血管内皮细胞(RMECs),用含20%优质胎牛血清的内皮细胞培养液进行原代培养,置于5%CO2、37℃饱和湿度的培养箱中孵育。隔天换液一次,5～7d细胞呈单层密集生长。当细胞长至亚融合时即可传代,用0.125%的胰蛋白酶消化细胞。用以下方法进行鉴定:(1)形态学观察:倒置相差显微镜下观察原代细胞形态及生长特性;(2)Ⅷ因子相关抗原免疫荧光法检测:一抗为兔抗鼠Ⅷ因子相关抗原(1:300),二抗为羊抗兔IgG一TRITC(1:100);(3)管腔样结构实验:观察上述分离培养细胞能否在Matrigel上形成管腔样结构。
三、实验分组
分为对照组、剂量效应组和时间效应组;剂量组包括:西洛他唑0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L,普罗布考1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L、30μmol/L,两药不同浓度相互配伍16组,分别作用细胞24小时收集培养上清液;时间组包括:西洛他唑1μmol/L、普罗布考3μmol/L、西洛他唑1μmol/L+普罗布考3μmol/L分别作用细胞0、3、6、12、24、36小时收集培养上清液。
四、双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法检测t-PA和PAI-1蛋白浓度
人、鼠t-PA与PAI-1酶联免疫吸附检测试剂盒购自于美国R&D公司。用纯化的抗体包被微孔板,制成固相抗体。向包被单抗的微孔中依次加入待测样品(HUVECs和RMECs培养上清液)、生物素化的抗人或鼠t-PA与PAI-1抗体、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)标记的亲和素,置入37℃恒温箱中温育60分钟,经过彻底洗涤后用底物四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)显色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值,计算样品浓度。
五、统计学处理
每项实验重复3次,采用SPSS13.0软件进行统计分析。实验数据用平均数士标准差表示,多组均数比较用方差分析,相关性比较采用Pearson分析方法,P＜0.05为差异有统计学意义。
实验结果:
普罗布考浓度在(1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L、30μmol/L)范围内以剂量依赖和时间依赖的方式降低HUVECs和RMECs中PAI-1合成与分泌,升高HUVECs中t-PA浓度及t-PA/PAI-1比值,同时增大RMECs中t-PA/PAI-1比值(P＜0.05或P＜0.01)。而对RMECs的t-PA浓度无明显影响。
西洛他唑浓度在(0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L)范围内以剂量依赖和时间依赖方式抑制HUVECs和RMECs中PAI-1的合成与分泌,上调HUVECs中t-PA合成与分泌,同时升高HUVECs和RMECs中t-PA/PAI-1比值(P＜0.05或P＜0.01)。而对RMECs的t-PA浓度无明显影响。
与单独作用组相比,普罗布考与西洛他唑联合作用组HUVECs和RMECs中PAI-1浓度均降低,t-PA/PAI-1比值均升高,HUVECs中t-PA浓度也升高(P＜0.05或P＜0.01),尤其是普罗布考30μmol/L+西洛他唑10μmol/L两药联合应用有协同效应(析因分析中普*西P＜0.01)。
结论:
1、普罗布考可不同程度地抑制HUVECs和RMECs合成及分泌PAI-1,促进HUVECs合成及分泌t-PA,呈剂量依赖性和时间依赖性。
2、西洛他唑可不同程度地下调HUVECs和RMECs中PAI-1水平,上调HUVECs中t-PA水平,呈剂量依赖性和时间依赖性。
3、普罗布考与西洛他唑联合应用对血管内皮细胞纤溶活性的促进作用有协同效应,可以推测普罗布考与西洛他唑对调节动脉粥样硬化纤溶活性有重要作用。