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膀胱发生先天畸形、后天损伤或肿瘤时,往往需要重建修复手术,才能恢复膀胱的结构和功能。在膀胱重建修复术中,人们常用胃肠道作为重建修复材料,但会产生多种并发症,如酸碱代谢紊乱、黏液分泌、逆行感染、结石和恶性肿瘤等。术后,重建的膀胱收缩功能差,容易产生剩余尿增多和排尿困难。如何解决新膀胱收缩力不足和胃肠道粘膜并发症的缺点一直是泌尿外科医生面临的难题。目前,由于缺乏适当的重建材料,胃肠道膀胱成形术依然是膀胱重建修复的金标准。因此,探索新的膀胱重建修复材料,是十分必要的。鉴于此,我们构建一种定向修复功能生物材料,通过基因工程技术,在生长因子bFGF上藕联特异结合胶原材料的胶原结合区(Collagen binding domain, CBD),然后将带胶原结合区的bFGF与胶原支架材料复合,通过CBD的藕联,bFGF就被锚定在胶原支架材料上。该体系具有生物可降解、免疫原性低、靶向释放bFGF的特性,一方面可以以定点、持续的方式提供再生信号分子,同时外源的胶原支架材料也为细胞增殖和组织再生提供了三维空间。本课题研究包括以下三个部分:第一部分:CBD-bFGF、NAT-bFGF的蛋白表达、纯化及鉴定。本部分实验通过基因工程技术,分别设计CBD-bFGF和NAT-bFGF蛋白的表达序列,利用pET28a载体进行蛋白表达,Ni柱亲和纯化,将蛋白诱导表达之后,15%SDS-PAGE观察, NAT-bFGF重组蛋白与CBD-bFGF重组蛋白分别在19kD与21kD之间出现了明显的条带,而且二者位置不同,原因是因为带胶原结合区的bFGF(CBD-bFGF)蛋白由于多了一段CBD,所以要比天然的bFGF(NAT-bFGF)大一些。为了能够得到更准确的结果,我们同时做了Western-blotting分析,可以看到在相应的位置出现了两条明显的条带。第二部分:CBD-bFGF和NAT-bFGF的蛋白活检测CBD-bFGF/Collagen和NAT-bFGF/Collagen修复材料的制备。我们选择促进人成纤维细胞增殖的MTT分析实验,来检测表达的蛋白的生物学活性。生长因子CBD-bFGF和NAT-bFGF激成纤维细胞增殖3天后,加入MTT,DMSO溶解后测量OD492值。结果显示,成纤维细胞的增殖速度的指标OD492的高低有明显的剂量依赖效应,随着浓度的增高,细胞的增殖速度也加快,CBD-bFGF和NAT-bFGF组的两条增殖曲线并没有明显的区别。统计结果显示,两组在每个浓度的OD值没有显著的差异,表明CBD-bFGF和NAT-bFGF不仅有活性,而且二者的活性是相近的。我们在检测了生长因子的活性之后,对CBD-bFGF和NAT-bFGF的胶原结合能力进行了分析,以确认CBD-bFGF是否能有效的与胶原结合。我们分别把CBD-bFGF和NAT-bFGF与胶原包被的96孔酶标板结合,再用ELISA方法检测结合量的差异。405nm的吸光度结果提示, CBD-bFGF在胶原蛋白上的残留量要显著多于NAT-bFGF蛋白。这一结果显示了CBD-bFGF的特异胶原结合能力,其胶原结合能力大大提高。将等量的NAT-bFGF和CBD-bFGF分别加载在胶原蛋白上,然后浸泡在PBS中,在不同时间点利用ELISA实验来检测残留在胶原蛋白表面的bFGF含量,从而确定bFGF的释放速度。结果显示,前7天每个时间点CBD-bFGF在胶原膜上的残留量都要显著高于NAT -bFGF,也就是说前者的释放速度明显低于后者,CBD-bFGF在胶原蛋白上具有更好的体外缓释能力。我们将胶原包被到48孔板上,然后加入不同浓度的NAT-bFGF和CBD-bFGF浸泡,1小时后将溶液吸出,PBS洗涤4遍后,将成纤维细胞接种到此48孔板。72小时后,MTT检测成纤维细胞增殖情况。结果提示,在不同的浓度梯度,CBD-bFGF组的成纤维细胞的增殖速度明显高于NAT-bFGF组。统计结果显示,两组在OD值具有显著的差异。表明CBD-bFGF能更长时间维持在胶原蛋白上发挥其生物学作用。第三部分:CBD-bFGF/ Collagen和NAT-bFGF/Collagen修复材料对大鼠膀胱损伤模型进行重建修复。我们进行了体内功能实验,进一步考察CBD-bFGF活化的胶原功能生物材料对于损伤修复的促进作用。我们选用大鼠膀胱重建修复模型,分PBS/Collagen组、NAT-bFGF/Collagen组、CBD-bFGF/Collagen组及Sham-operated组,30d和90d作为取材观察时向点。结果显示,CBD-bFGF/Collagen组能较好的促进膀胱组织再生,血管化和肌肉化显著高于PBS/Collagen组和NAT-bFGF/Collagen组,尿动力学分析表明,有和Sham-operated组相似的膀胱顺应性,显示了CBD-bFGF/Collagen定向结合修复系统在促进损伤修复,提高修复质量上的巨大作用。综上所述,我们利用基因工程方法,在成纤维细胞生长因子bFGF上耦联能够特异结合的胶原的胶原结合区肽(CBD),结果显示CBD-bFGF在保持生物学活性的同时,能够有效地靶向结合在胶原材料上。在大鼠膀胱重建修复动物模型中,CBD-bFGF/Collagen定向修复材料能够更好地促进膀胱膀胱组织再生和功能恢复,显示了CBD-bFGF/Collagen定向修复材料在膀胱重建中的巨大潜力。本课题探索应用组织工程技术制备膀胱替代材料,为膀胱重建提供新的技术和方法,有广阔的研究价值和临床应用前景。