在脑缺血的研究中发现,局灶性脑缺血能激活局部AS使其活性增强并产生神经生长因子发挥脑保护作用,若其它无缺血部位AS也能激活产生神经营养因子,将更有效的保护缺血半暗带的神经元。本实验探讨药物激活正常AS保护神经元。目的:离体培养AS,观察药物能否激活AS;明确药物对AS内皮素受体-B表达有何影响。方法:1出生48小时内的健康SD大鼠,分离大脑皮层并进行AS体外培养。原代细胞经纯化后纯度达到95%以上者用于实验。2细胞毒性实验初筛药物对AS的安全浓度。取经3次传代培养的大鼠乳鼠AS,随机分为实验组和对照组。对照组加入相同体积的培养基,各实验组中分别加入不同浓度药物,MTT比色法对AS进行药物毒性分析。根据分析结果确定本实验的安全药物浓度。3流式细胞术测定细胞增殖激活情况。将AS随机分为对照组和药物组。对照组加入相同体积的培养基,实验组分别在细胞培养24小时、48小时、72小时后加入不同浓度药物,加入药物后继续培养24小时。流式细胞仪测细胞周期,结合增殖指数(PrI值)了解AS的增殖激活情况。4荧光免疫法测定药物对内皮素受体-B表达的影响。将AS随机分为对照组和药物组。对照组加入相同体积的培养基,药物组加入不同浓度药物作用24小时后固定细胞爬片,封闭并加入内皮素受体-B抗体过夜,加荧光二抗,最后PI染核。荧光显微镜下观察。测阳性细胞数和平均光密度,了解药物对内皮素受体-B表达的影响。实验数据处理。计量资料以均数±标准差( X±S)表示,应用SPSS12.0软件统计。各组间比较用方差分析(ONE—WAY—ANOVA),P<0.05具有统计学意义。结果:1原代培养的AS分离纯化后经GFAP鉴定,纯度达到96%,可以作为实验细胞。2 MTT初筛药物安全浓度。根据MTT分析结果得出药物作用于AS的安全浓度为小于8mg/ml,在安全浓度中各实验组相比较, 4mg/ml实验组抑制率最小,具有统计学意义(P<0.05)。3流式细胞技术测药物浓度4 mg/ml各时间点DNA合成期(S期)细胞所占比例和增殖指数(PrI)。各时间点药物组均能促进细胞增殖,具有统计学意义(P<0.01)。药物作用48小时其DNA合成期细胞所占百分比(S%)和PI值(S+ G2·M-1)×100%显著增高,提示药物对AS具有增值作用,在48小时作用最明显。4荧光免疫法测药物对AS内皮素受体-B表达的影响。药物浓度4mg/ml和5mg/ml所得荧光图片的平均光密度值明显高于其他实验组。药物浓度5mg/ml荧光图片的阳性细胞数多于其他实验组和对照组,具有统计学意义(P<0.01)。结论:1丹红注射液作用于体外培养AS的安全浓度为小于8mg/ml。2浓度4mg/ml丹红注射液可以激活AS并使其增值。3浓度5mg/ml丹红注射液可以使AS内皮素受体-B表达上调。4用药物激活AS发挥保护神经元作用是可行的。