论文部分内容阅读
指状青霉(Penicillium digitatum)是引起柑橘采后病害的主要致病菌,造成了柑橘产业严重的经济损失。化学杀菌剂处理是目前柑橘采后生产中防治柑橘采后病害的主要方法,但目前常用的化学杀菌剂存在作用靶点单一,易使病原菌产生耐药性的问题,使杀菌剂的使用周期大大缩短。研究与开发安全、高效、低耐药性、具有新型药物作用靶点的杀菌剂对于柑橘采后安全生产具有十分重要的意义。研究表明,细胞内pH平衡对病原真菌的生长发育和毒力至关重要。酵母是单细胞真核模式生物,结构较简单,蛋白较少,是研究真核生物生理过程的良好模式生物。本试验通过在酵母质子运输相关基因缺失的突变体中筛选出与真菌生长、胞外产酸能力和唑类药物作用至关重要的基因―V-ATPaseH亚基,研究该基因在指状青霉的生长、胞外pH调控和致病力中的作用。主要结果如下:(1)从酵母菌突变体库中筛选出了对真菌生长、胞外产酸能力和唑类药物作用的关键基因VMA13,即V-ATPaseH亚基。(2)指状青霉的VmaH(V-ATPaseH亚基)具有与其他真菌同样的2个非常保守的结构域,分别为N端结构域和C端结构域。真菌物种中VmaH的氨基酸相似度为79%,且指状青霉VmaH与青霉属和曲霉属的VmaH具有较近的亲缘关系。VmaH在指状青霉整个生长发育和侵染果实过程中一直保持较高的基因表达水平,并在不同外界环境胁迫条件下表现出不同的表达模式。(3)本试验以pCAMBIA3300质粒作为骨架,成功构建了VmaH基因过表达载体p-5HPV3-3300和两组RNA干扰载体p-PS-A-Hyg B-3300及p-pgpd A-VmaHPtrpC-Hyg B-3300。利用根癌农杆菌介导指状青霉转化分别获得一株VmaH过表达突变株OE12和一株VmaH沉默突变株Si14。(4)VmaH对指状青霉的菌丝形态影响较小。VmaH基因的沉默会导致指状青霉孢子萌发时间的推迟、菌丝生长速率减慢且产孢量下降。VmaH基因在指状青霉侵染柑橘类果实方面具有正向调控作用,过表达菌株的病斑直径显著大于野生型菌株的病斑直径;沉默菌株的病斑直径较野生型小,且未观察到肉眼可见的菌丝生长和绿色孢子扩散的现象。VmaH过表达菌株培养液的pH和野生型菌株培养液的pH差异不显著,而VmaH沉默菌株培养液的pH显著低于对照菌株和过表达菌株。