论文部分内容阅读
目的:探讨miR-34b/miR-23a靶向Keap1/ULK1调控大鼠脑缺血再灌注氧化应激反应的分子机制。方法:（1）应用QPCR技术检测I/R大鼠脑梗死核心组织中miR-34b/miR-23a的表达水平;通过慢病毒技术在MCAO大鼠脑组织中过表达miR-34b/miR-23a,再灌注后Berdron评分与TTC染色检测大鼠的神经损伤和脑梗死体积,化学比色法测定总SOD、NO和MnSOD含量,ELISA检测3-NT含量;（2）借助QPCR和Western blot技术检测I/R大鼠脑梗死核心组织中Keap1/ULK1的表达情况,检测miR-34b/miR-23a对Keap1/ULK1的表达调控,并用双荧光素酶实验验证miR-34b/miR-23a与Keap1-3′-UTR/ULK1-3′-UTR的靶向结合位点;（3）采用H2O2诱导细胞氧化损伤,分别上下调Keap1,过表达miR-34b和Keap1,过表达miR-23a和ULK1,再用化学比色法测定总SOD、NO与MnSOD的含量,ELISA检测3-NT的含量。结果:（1）相较于假手术组,I/R大鼠脑梗死核心组织中miR-34b表达量显著降低,在再灌注后1、4、24h呈下降趋势;miR-23a表达量在再灌注后1h最低,4h及24h后有明显回升;相较于对照慢病毒组,过表达miR-34b/miR-23a慢病毒组大鼠的神经损伤评分和脑梗死体积均显著降低;3-NT与NO含量均显著下降,总SOD与MnSOD含量均显著上升;（2）相较于假手术组,I/R大鼠脑梗死核心组织中Keap1表达量下降,Nrf2和HO-1表达量上升;ULK1表达量在再灌注后1h和4h升高,24h后下降;与对照组相比,过表达miR-34b组中Keap1表达量下降,Nrf2和HO-1表达量上升;与对照组相比,过表达miR-23a组中ULK1表达量下降;Keap1-3′-UTR/ULK1-3′-UTR野生型转染组,miR-34b/miR-23a模拟物可以抑制荧光活性,抑制剂可以促进荧光活性;Keap1-3′-UTR/ULK1-3′-UTR突变型转染组,各组荧光活性无显著性差异;（3）与对照组相比,Keap1过表达组中3-NT与NO含量均显著上升,总SOD与MnSOD含量均显著下降,Keap1干扰组中结果与之相反;与对照组相比,miR-34b模拟物组中3-NT与NO含量均显著下降,总SOD与MnSOD含量均显著上升,同时转染Keap1过表达质粒可显著回复miR-34b的影响;miR-23a模拟物组中3-NT与NO含量均显著下降,总SOD与MnSOD含量均显著上升,同时转染ULK1过表达质粒可显著回复miR-23a的影响。结论:（1）miR-34b和miR-23a是I/R大鼠脑梗死的保护因子;（2）miR-34b/miR-23a可以分别靶向下调Keap1/ULK1从而抑制脑缺血再灌注氧化损伤。