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目的一氧化氮(Nitric oxide,NO)化疗增敏是当前研究的热门,高浓度的NO可以通过多种机制增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本实验拟通过观察不同浓度NO供体药物硝普钠(SNP)、顺铂(DDP)以及SNP+DDP联合对鼻咽癌CNE-2细胞株的影响。观察外源性的NO在DDP作用于细胞株CNE-2的过程中是否存在增敏效应,并探讨其可能的机制,为有效提高鼻咽癌化疗或同期放化疗疗效提供实验和理论依据。方法1.细胞培养:选用鼻咽癌细胞株CNE-2作为研究对象,在含10%biowest胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)培基中置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养,取对数增殖期CNE-2细胞株进行实验;2.倒置相差显微镜观察CNE-2细胞株形态学厘革:分别按SNP1组(SNP200umol/L)、SNP2组(SNP600umol/L)、SNP3组(SNP1000umol/L)、DDP组(DDP20000nmol/L)、SNP1+DDP联合组(SNP200umol/L+DDP20000nmol/L)、SNP2+DDP联合组(SNP600umol/L+DDP20000nmol/L)及SNP3+DDP联合组(SNP1000umol/L+DDP20000nmol/L)干预CNE-2细胞株,等量培养基作为NC组(Negative control,阴性对照组),细胞培养箱中继续培养24h后镜下(×100)观察细胞形态变化;3.CCK-8法测定CNE-2细胞株的增殖抑制率:取对数生长的CNE-2细胞,将分别按SNP1组、SNP2组、SNP3组、DDP组、SNP1+DDP联合组、SNP2+DDP联合组及SNP3+DDP联合组干预CNE-2细胞,等量培养基作为NC组,24h后采用CCK-8方法测定OD值并计算各组对细胞株CNE-2的增殖抑制率[抑制率=(1-处理组/对照组)×100%];4.硝酸还原酶法检测NO含量:取第(3)步中各分组中的上清液检测其中NO的浓度;5.流式细胞术测定细胞株CNE-2的凋亡率:取对数生长期的CNE-2细胞,分别按NC组、SNP2组(SNP600umol/L)、DDP组(DDP20000nmol/L)及SNP2+DDP联合组(SNP600umol/L+DDP20000nmol/L)干预24h后进行流式细胞术检测,并用cell Quest软件算出细胞株的凋亡率;6.统计学分析:本研究各试验数据均以均数±标准差(`χ±s)表示,统计学分析采用SPSS 19.0 for windows进行分析。两独立样本间均数的比较采用Indepentent-Sample T Test,多个独立样本间的两两比较,方差齐性者采用One-Way ANOVA分析,方差不齐者采用Kruskal-Wallis H Test,均为双侧检验,其水准α=0.05。各种统计图采用SPSS 19.0 for windows和Microcoft Excel统计软件获得。结果1.不同SNP浓度的上清液中NO的浓度变化:SNP1组、SNP2组、SNP3组与NC组相比,NO含量具有显著差异(230.4095±0.958153 VS 88.1777±0.422719,t=-192.070,P<0.05;323.6549±1.375172 VS 88.1777±0.422719,t=-243.526,P<0.05;387.1118±1.69286 VS88.1777±0.422719,t=-292.482,P<0.5);SNP1、SNP2和SNP3组三者之间两两对比,NO含量具有显著差异(387.1118±1.69286 VS323.6549±1.375172VS230.4095±0.958153,F=8104.661,P=0.000<0.05)。上清液中NO浓度与SNP浓度呈正相关,有统计学意义(r=0.961,P=0.039<0.05)。2.CNE-2细胞形态学变化:NC组细胞株呈多边形贴壁生长,轮廓清晰,胞质饱满,大小均匀;SNP药物浓度越高,细胞存活率越低,细胞形态改变愈明显,SNP1组CNE-2细胞数量较NC组增多,SNP2组较NC组细胞数量稍减少,大小不一,部分细胞见间隙结构不清楚,SNP3组细胞变小变圆,折光度明显下降。SNP2+DDP联合组和SNP3+DDP联合组较之单用DDP药物培养的细胞相比,漂浮细胞显著增多,贴壁数量逐渐减少并失去原有形态,可见大量的细胞碎片。3.CNE-2细胞增殖抑制率的变化:SNP1组、SNP2组、SNP3组干预CNE-2细胞24h后的抑制率分别为(-7.342±0.6047、3.3899±1.0622、52.3524±1.0239)%,随着SNP药物浓度增强,细胞增殖抑制率明显增高,差异具有显著性(检验统计量=7.322,P=0.026<0.05);DDP组干预CNE-2细胞24h后的抑制率为(43.6473±1.0348)%;SNP1+DDP联合组、SNP2+DDP联合组、SNP3+DDP联合组分别干预CNE-2细胞24h后的抑制率为(52.0065±1.4293)%、(78.5137±0.2429)%和(95.1610±1.0439)%,不同联合组之间细胞株增殖抑制率的差异具有统计学意义(检验统计量=7.385,P=0.025<0.05);SNP1+DDP联合组干预CNE-2细胞24h后的增殖抑制率比DDP组有所提高,但差异无统计学意义(t=1.220,P=0.251>0.05);SNP2+DDP联合组和SNP3+DDP联合组干预CNE-2细胞株24h后的增殖抑制率比DDP组显著提高(t=9.049,P=0.000<0.05;t=3.536,P=0.005<0.05);SNP3+DDP联合组比SNP2+DDP联合组的细胞增殖抑制率显著提高,差异有统计学意义(t=-5.287,P<0.05)。说明SNP以浓度依赖性方式抑制CNE-2细胞增殖。4.CNE-2细胞凋亡的变化:NC组CNE-2细胞的自发凋亡百分数为(1.21±0.28)%;SNP2组的凋亡百分数为(3.44±0.14)%;DDP组CNE-2细胞的凋亡百分数为(33.37±1.74)%;SNP与DDP联用时CNE-2细胞凋亡百分数为(45.62±1.56)%,较SNP、DDP单药组显著增强,差异均具有显著性(t=-26.930,P=0.022<0.05;t=-5.242,P=0.035<0.05)。结论(1)外源性NO能抑制CNE-2的增殖,其抑制效应与NO浓度呈正相关;(2)外源性NO能显著增强DDP对CNE-2细胞株的化疗敏感性,其增敏效应与NO浓度呈正相关。