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目的本研究宗旨:(1)六种6,7-呋喃香豆素类化合物对耐药脑胶质瘤细胞U251/TR和非耐药的脑胶质瘤U251细胞增殖抑制作用的影响;(2)六种6,7-呋喃香豆素类化合物与替莫唑胺联合用药对U251/TR细胞增殖的影响;(3)探讨六种6,7-呋喃香豆素类化合物对P-gp功能的影响;(4)探讨六种6,7-呋喃香豆素类化合物对P-gp表达的影响。从而为呋喃香豆素类化合物对逆转肿瘤细胞耐药提供理论依据。方法1.六种6,7-呋喃香豆素类化合物对抗肿瘤活性影响运用多功能酶标仪采用MTT法检测不同浓度的六种6,7-呋喃香豆素类化合物对耐药细胞U251/TR和非耐药细胞U251给药时细胞增殖的影响;运用多功能酶标仪检测六种6,7-呋喃香豆素类化合物与替莫唑胺单独或联合给药对耐药U251/TR细胞增值的影响以检测呋喃香豆素化合物对化疗药物对肿瘤细胞杀伤的增敏作用。2.六种6,7-呋喃香豆素类化合物对P-糖蛋白功能的影响取六种6,7-呋喃香豆素类化合物与维拉帕米分别单独作用于人脑胶质瘤U251细胞和耐药的人脑胶质瘤U251/TR细胞24小时后,立即停止药物作用,加入100μl的10μmol/L罗丹明123作用两小时后,用PBS清洗3次,再用多功能酶标仪于485nm激发波长,535nm发射波长检测荧光强度。通过罗丹明123外排实验检测耐药细胞U251/TR和U251细胞内罗丹明123的残留量来验证六种6,7-呋喃香豆素类化合物对P-gp功能的影响。3.六种6,7-呋喃香豆素类化合物对P-糖蛋白表达的影响取六种6,7-呋喃香豆素类化合物与维拉帕米分别单独作用于耐药的人脑胶质瘤U251/TR细胞48小时后,立即停止药物作用,加入高效裂解液,提取蛋白,采用BCA蛋白定量法对蛋白进行定量,调整蛋白浓度。采用western blot法检测六种6,7-呋喃香豆素类化合物对P-gp表达的影响。结果六种6,7-呋喃香豆素对人脑胶质瘤U251细胞及U251/TR细胞的IC50最小值也在100μM以上,说明六种6,7-呋喃香豆素类化合物对人脑胶质瘤细胞U251毒性均较低。取替莫唑胺的浓度为10~3μM、1.5×10~3μM、2.0×10~3μM、2.5×10~3μM的完全培养基与呋喃香豆素类药物浓度为25μM、50μM、75μM和100μM分别单独给药和联合给药,能有效增敏TMZ对U251/TR细胞抑制率,并且呈一定程度浓度依赖性((P<0.05)。联合用药指数评价六种6,7-呋喃香豆素联合作用指数为0.416-0.962(P<0.05),具有明显的协同作用,其中补骨内酯、欧前胡素、异欧前胡素与替莫唑胺联用较花椒毒素、花椒毒酚、香柑内酯对U251/TR细胞的协同作用较强。罗丹明蓄积实验中六种6,7-呋喃香豆素类化合物作用于U25/TR细胞24小时后对罗丹明外排均有一定的抑制效果;与经典药物维拉帕米比较欧前胡素与异欧前胡素效果分别是维拉帕米的1.14和1.19倍,其余香豆素效果均略低于维拉帕米(P<0.01);六种6,7-呋喃香豆素类化合物与经典药物维拉帕米作用于U251细胞24小时后对罗丹明在细胞内的蓄积未见明显差异,蓄积量较U251/TR细胞相比明显增多(P>0.05)。两种香豆素作用于U251/TR细胞48小时后,提取的蛋白通过western blot检测欧前胡素与异欧前胡素均能影响P-gp表达。结果表明每种浓度的欧前胡素与异欧前胡素均可减少P-gp的表达量,随着浓度的增加,P-gp的表达量减少(P<0.05)。结论1.六种6,7-呋喃香豆素类化合物均能不同程度增加替莫唑胺对耐药脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用。2.六种6,7-呋喃香豆素类化合物对P-gp的活性均有一定的抑制作用,与经典药物维拉帕米比较欧前胡素与异欧前胡素效果较好。3.欧前胡素与异欧前胡素是通过抑制P-gp的表达,来抑制其活性,进而起到逆转肿瘤细胞耐药。