香蕉(Musa spp.)是全世界最重要的水果和粮食作物之一,是福建省重要的农业组成部分,福建省具有丰富的栽培香蕉和野生蕉资源,但是福建栽培香蕉受到寒冷、病虫害等严重威胁,选育抗性香蕉品种是香蕉研究的重点课题,因此,具有优良抗性特点的野生蕉是香蕉育种研究的宝贵资源。开展香蕉种质资源的收集是利用的前提工作,对遗传背景不清晰的野生蕉进行遗传结构和遗传多样性研究亦显得迫切,进一步开展香蕉抗寒性研究可为香蕉抗寒育种研究奠定理论基础。本试验主要内容包括福建香蕉试管苗保存研究、福建野生蕉自然居群遗传结构和遗传多样性ISSR分析、三明野生蕉抗寒生理响应研究、三明野生蕉抗寒基因脂肪酸去饱和酶家族基因(FADs)克隆和表达分析,主要研究结果如下：1福建香蕉种质资源试管保存研究①福建若干香蕉品种(系)花序诱导植株再生以福建野生蕉、粉蕉等6个香蕉品种(系)的未成熟雄花序为材料,建立不同品种香蕉花序诱导植株再生体系,并比较其再生特性。结果显示,香蕉花序的最佳消毒方式为75%酒精消毒20min,污染率为4.45%；不定芽的最佳诱导培养基为MS+NAA0.1mg·L-1+6-BA2.5mg·L-1,诱导率可达46.67%；以MS+NAA1.0mg·L-1为培养基可获得生长健壮的香蕉生根苗,移栽基质为泥炭土：田园土：珍珠岩(2：2：1)；栽培香蕉和野生蕉的再生特性具有较大的差异,栽培香蕉不定芽诱导时间较短,芽体大,试管苗粗壮,根系发达,茸毛明显,野生蕉诱导时间较长,不定芽易形成多芽体结构,试管苗相对瘦细,根系细长。②福建香蕉种质资源试管苗保存研究香蕉试管苗限制生长保存研究结果表明,影响丛生芽高度、丛生芽总数、丛生芽黄化率和叶绿素含量的因素及其作用大小分别是：甘露醇>6-BA>ABA>NAA、甘露醇>NAA>6-BA>ABA、甘露醇>6-BA>NAA>ABA和6-BA>NAA>甘露醇>ABA。较高浓度的甘露醇和ABA利于香蕉试管苗的保存。试验筛选到最佳保存培养基为MS+0.5mg·g-16-BA+1.0mg·g-1NAA+1.0mg·g-1ABA+3.0%甘露醇,pH为5.8,并以筛选的最佳保存方案对福建若干香蕉资源进行了试管保存。试验过程建立了“GS-YI”评价体系(生长状态-黄化指标,Growth Status-Yellowing Index)进行香蕉离体保存效果的评价,评价指标包括试管苗高度、芽数、植株形态、黄化率、黄化等级和叶绿素含量。2福建中部3个野生蕉自然居群遗传结构和遗传多样性的ISSR分析对采自福建省三明市和福州市的3个野生蕉自然居群共100份叶片样本进行ISSR分析,结果表明：13条引物共扩增获得175个稳定、清晰的条带,平均扩增条带数为13.5个,扩增产物主要介于200-2000bp,其中总的多态性条带为158个,居群总多态性条带百分率为90.3%；通过NTSYS和STRUCTUR软件聚类分析发现,岩前、莘口和赤壁野生蕉共100份样本严格按照地理来源划分为3个大组,3个大组可进一步分别划分为3、3和4个亚组；采用POPGENE进行遗传多样性参数分析发现,野生蕉居群总的变异中,群体内变异大于群体间变异,野生蕉居群内存在丰富的基因交流,3个野生蕉居群总体多样性水平较高,从高到低依次为岩前、莘口和赤壁。3三明野生蕉叶片在低温胁迫下的生理变化规律相对电导率和脯氨酸是2个衡量植物抗寒的重要生理指标,通过测定在低温胁迫下三明野生蕉叶片相对电导率和脯氨酸含量,可以初步明确三明野生蕉在低温下的抗寒生理变化模式。①不同温度处理下,当温度由28℃降低至0℃的过程中,相对电导率总体上呈先升后降再升的趋势,而脯氨酸含量随着温度的降低呈先降后升再降的变化规律,两者呈负相关。当温度为16℃和13℃时,是电导率和脯氨酸发生剧烈变化的温度,说明三明野生蕉叶片在16℃时开始受到低温影响并启动抗寒响应。②随着低温(16℃)持续时间的增加,三明野生蕉叶片相对电导率呈“降-升-降-升”的变化模式,而脯氨酸变化模式与相对电导率变化的模式相反,呈现为“升-降-升-降”。在整个低温持续进程中,相对电导率和脯氨酸均分别于16h和36h时出现明显的拐点,此2个时间点分别是抗寒响应强烈和低温伤害严重的时刻,当低温处理时间达到72h时,低温伤害加剧。③三明野生蕉叶片于连续降温环境下进行处理,当温度由28℃持续降温到一定低温时(10℃),相对电导率持续下降的同时,脯氨酸含量亦呈现下降趋势,说明此时香蕉叶片并未受到低温伤害,导致此现象的原因可能是：温度的降低过程是一个缓慢的过程,此时低于16℃的累积处理时间仅为9h,三明野生蕉对缓慢下降的温度、短时间的低温环境产生了耐受性。随着温度继续降低,低温胁迫时间延长,野生蕉受到寒冷伤害并启动抗寒防御,此过程中三明野生蕉可维持一定的“伤害-抗寒”平衡。4三明野生蕉FAD家族基因克隆及生物信息学分析①小果野蕉(Musa acuminata)全基因组FAD家族基因分析"DH-Pahang"小果野蕉全基因组FAD家族基因检索结果获得17个FAD基因成员,其中FAD2基因7个,FAD3和FAD6各1个,FAD7基因8个(其中3个未有完整CDS)。FAD基因CDS的长度介于1035bp与1344bp之间,FAD2的内含子为1-3个,FAD3和FAD6分别为4和9个,FAD7的内含子为7或8个,内质网型FADs (FAD2和FAD3)的编码氨基酸序列长度总体低于质体型FADs (FAD6, FAD7, FAD8)。香蕉全基因组FAD蛋白保守结构域预测显示均为Membrane-FADS-like家族成员,部分FAD蛋白还具有cyt-b5和DUF3474结构域。亚细胞定位预测表明4类FAD蛋白的定位总体上以内质网和叶绿体为主。所有蛋白均具有跨膜结构,跨膜螺旋数目最少为1个,最多为5个,以由内而外的跨膜方向居多。二级结构中以α螺旋和无规折卷曲所占比例最高,延伸链和p转角比例较低。卷曲螺旋和信号肽预测显示FAD蛋白无螺旋卷曲结构,也不具信号肽,不是分泌蛋白。在SWISS-MODEL中预测到了3个FAD2蛋白的三维结构模型,分别是MuFAD2、MuFAD2-2a和MuFAD2-2e,而其他FAD成员均未有预测模型。②三明野生蕉FAD家族基因克隆及生物信息学分析试验克隆得到三明野生蕉15个FAD基因成员(包括可变剪接形式),其中FAD2基因6个(MU-FAD2、Mu-FAD2a、Mu-FAD2-2a、Mu-FAD2-2b、Mu-FAD2-2c、Mu-FAD2-2d), FAD3基因2个(Mu-FAD3-1a、Mu-FAD3-1b), FAD6基因1个(Mu-FAD6), FAD7基因6个(Mu-FAD7-2a、Mu-FAD7-2b、Mu-FAD7-3、Mu-FAD7-4、Mu-FAD7-5a、Mu-FAD7-5b)。15个FAD基因开放阅读框(ORF)的大小介于1146bp和1844bp之间,可正常编码的氨基酸残基数目介于381和456个。生物信息学预测结果表明三明野生蕉FADs保守结构域均有Delta12-FADS-like结构域和DUF3474特异结合位点,属于Membrane-FADS-like超家族。亚细胞定位以内质网和叶绿体为主。FADs具跨膜结构,磷酸化修饰主要以丝氨酸为主。二级结构预测结果表明FADs家族成员中,a螺旋和无规则卷曲占有绝大比例,不具卷曲螺旋和信号肽。预测到了2个FAD2蛋白的三维结构模型,分别是MuFAD2-2a,MuFAD2-2e。5三明野生蕉试管苗FAD家族基因定量表达分析及FAD7转化烟草研究试验比较了不同温度、水杨酸及其不同处理时间下FAD家族成员的相对表达量。①水杨酸处理下FADs的表达量总体低于去离子水处理。由于SA处理维持了香蕉试管苗叶片细胞膜结构的完整性,未通过诱导FADs高表达产生抗寒响应；反之,当以去离子水处理时,香蕉试管苗仍然遭受低温伤害,因此FADs受到诱导,大量表达以防御低温伤害。同时,FADs在各个处理下的表达模式呈现多样化。②8℃低温不同处理时间下FAD成员的表达模式差异较大,短时间的低温处理(1h)下,FADs的表达均低于未处理,因此突然降温可抑制FADs的表达；随着低温持续时间的延长,FADs表现为长期低温诱导型和非诱导型2类,前者包括FAD2-1、FAD3和FAD7-2,后者包括FAD2-2、FAD6和FAD7-1。③ADs在不同温度下的表达模式可归纳为2类,其一是升高降低型(FAD2-1、FAD2-2、FAD6, FAD7-2);其二是降低升高型(FAD3和FAD7-1)。在升高降低型的FADs表达模式中,在20℃C处理条件下,FADs出现转录高峰,其他温度的表达水平均较低,说明野生蕉FAD2-1、FAD2-2、FAD6、FAD7-2在环境温度刚开始发生变化时即感受低温并启动抗寒抵御；在降低升高型的FAD表达模式中,在温度变化的前期,即在一定低温以前(8℃C以前),随着温度的降低FAD3和FAD7-1表达量随之降低,表现为惰性反应,当温度下降至4℃C甚至0℃C的过程中,FAD3和FAD7-1基因受低温诱导表达,表达量急剧上升,因此2种类型的FADs表达特点不同,在整个变温过程中协同互补。将三明野生蕉Mu-FAD7-2a进行烟草遗传转化研究,转化验证结果表明转基因烟草阳性率为77.8%,将转基因烟草阳性植株进行低温胁迫处理以鉴定其抗寒性,结果表明Mu-FAD7-2a转化的烟草叶片低温下萎蔫程度低于对照组,转基因烟草表现了较强的抗寒特点。本试验结果说明Mu-FAD7-2a可能在转基因烟草低温防御过程中起到重要作用。