论文部分内容阅读
背景与目的目前,心肌梗死是一个全球性疾病,心力衰竭是心肌梗死最常见的并发症。心力衰竭的本质是心肌细胞(cardiomyocytes,CMs)的丢失与有效再生不足。目前,临床治疗心力衰竭的手段只能延缓病情,而不能从根本上解决CMs丢失的问题。促进CM再生是心脏损伤后修复的关键步骤,而促进内源性心肌增殖被认为是最有应用前景的心脏再生途径。众所周知,细胞增殖受细胞周期的调控,而CMs在出生后不久便退出细胞周期,CM增殖迅速停止,取而代之的生长方式是仅发生DNA合成和核有丝分裂而没有胞质分裂(无细胞分裂动力学有丝分裂)的内复制和肥大,这使得大多数心肌细胞处于双核状态。过去许多研究对哺乳动物心肌细胞增殖的观察主要是描述有限的DNA的合成及有丝分裂情况,对于胞质分裂的研究极少。而是否发生胞质分裂是判断CM增殖的重要依据之一。微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)可通过调控CMs的细胞周期影响CM增殖。致命性-7(Lethal-7,let-7)家族是在体细胞中广泛表达且高度保守的miRNAs家族。体外实验显示过表达let-7家族可降低CMs中胸腺嘧啶核苷类似物(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)结合率(新合成DNA标记物)和ki-67(增殖抗原标记物)阳性率,提示let-7i-5p可能是一个较强的CM增殖抑制剂[1]。本实验室前期研究显示抑制let-7i-5p可促进CMs的DNA合成与有丝分裂,促进心肌梗死后心功能的恢复。然而,let-7i-5p对于CM胞质分裂的影响还不清楚,尚不知道他是如何发挥作用的。本研究将通过胞质分裂、DNA复制、有丝分裂三个方面更全面的观察let-7i-5p对心肌细胞生长方式的影响,并进一步对机制进行探讨。方法1.观察小鼠不同鼠龄CMs的增殖活性。A.取胚胎16.5天(E16.5)、出生后1天(P1)、出生后56天(P56)小鼠心脏组织。B.免疫荧光方法观察心脏组织中pH3阳性CMs比例。2.Let-7i-5p在小鼠心脏不同发育时期的表达水平分析。A.分别取E16.5、E18.5、P1、P3、P7、P56小鼠的心脏组织,分离P1、P7、P10小鼠的原代CMs。B.Real-time PCR(qPCR)检测小鼠不同年龄段心脏组织和CMs中let-7i-5p的表达水平。3.体外干预let-7i-5p表达水平对小鼠乳鼠原代CM增殖的影响。A.分离并培养P1小鼠乳鼠原代CMs。B.过表达或者抑制let-7i-5p表达水平,通过免疫荧光染色方法观察CMs数量及EdU-/pH3-/Auroa B阳性CMs比例。4.探索let-7i-5p调控CM增殖的机制A.观察let-7i-5p与E2F2/CCND2结合序列的保守性。B.观察let-7i-5p对mRNA E2F2/CCND2蛋白水平的影响。C.使用8周龄雄性小鼠建立心肌梗死模型,建立模型后立即转染不同腺相关病毒9(adeno-associated virus 9,AAV9),实验分为四组,分别为AAV9-NC、AAV9-anti-let-7i-5p、AAV9-anti-let-7i-5p+AAV9-si-E2F2、AAV9-anti-let-7i-5p+AAV9-si-CCND2,注射后28天收集心肌组织。D.超声评估各组小鼠的心脏功能,通过动态观察LVEDd、LVSDd、LVFS、LVEF的变化;通过免疫荧光观察EdU阳性CMs在心肌组织中的比例。结果1.小鼠心肌细胞增殖活性随着鼠龄的增加而降低。2.Let-7i-5p的表达量随着鼠龄的增加而升高,成年鼠中let-7i-5p的表达量最高。3.抑制let-7i-5p的表达可促进CM的胞质分裂、DNA复制及有丝分裂,从而促进CM增殖,过表达let-7i-5p可抑制CM增殖。4.Let-7i-5p与E2F2/CCND2的结合序列高度保守,let-7i-5p可抑制E2F2和CCND2蛋白水平的表达。5.沉默E2F2或CCND2均可逆转let-7i-5p抑制介导的促梗死后心脏功能恢复以及促CMs增殖作用。结论抑制Let-7i-5p通过同时依赖E2F2和CCND2发挥促进CM增殖(以CMs胞质分裂、DNA复制及有丝分裂为特征)以及促进心肌梗死后心脏功能的恢复的作用。