[研究背景]:　　 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种具有较强促炎活性和免疫调节作用的重要细胞因子，通过与两种特异性细胞膜受体的相互作用发挥其生物学功能。Ⅰ型受体(TNFR1)主要介导TNF-α的促炎活性和细胞毒活性，而Ⅱ型受体（TNFR2）则更多地参与TNF-α的免疫调控和抗感染活性。直接抑制TNF-α活性的生物制剂如抗TNF-α抗体在多种炎症疾病的治疗中取得了重大进展，表明细胞外阻断这种促炎细胞因子是一种有效的治疗手段，而目前临床上使用的TNF-α拮抗剂同时抑制TNFR1和TNFR2介导的信号，因此，长期使用TNF-α拮抗剂会导致患者抗感染能力下降等严重的副作用。　　 从传统中药中发现有活性的天然先导化合物已经成为新药研发的重要途径之一，目前已经发现多种可以抑制TNF-α表达或阻断其活性的天然小分子化合物并用于炎症疾病的治疗，这些小分子药物可能成为生物制剂的替代品。然而，迄今已发现的大多数小分子TNF-α拮抗剂局限于机制不明的TNF-α表达抑制剂、基于细胞水平分析的机制不明的TNF-α活性抑制剂以及各种与TNF-α表达和活性相关的细胞内信号通路抑制剂，而能够直接抑制TNF-α与其受体相互作用的小分子TNF-α拮抗剂却鲜有报道。　　 本课题组在前期研究中发现一种从药用植物旋覆花中分离鉴定的倍半萜内酯二聚体XFH-31可能是新型的TNF-α拮抗剂，Biacore分析表明其能与TNF-α直接结合，ELISA和细胞学实验证明XFH-31能抑制TNF-α与TNFR1的相互作用，并阻断TNFR1介导的促炎活性。基于此，本研究继续对XFH-31和从旋覆花同一活性部位分离得到的XFH-31的结构类似物展开研究。　　 [研究目的]:　　 从旋覆花的倍半萜内酯类成分中发现一类以TNF-α为明确作用靶点的新型抗炎候选药物，为进一步的结构优化、分子设计和新型的TNF-α小分子拮抗剂研发奠定基础。　　 [研究方法]:　　 1、Biacore技术分析化合物与TNF-α的直接相互作用;　　 2、凝胶过滤、非变性凝胶电泳、圆二色谱法分析XFH-31对TNF-α立体构象的影响;　　 3、ELISA法分析TNF-α与其受体的相互作用，细胞实验检测125I标记的TNF-α与L929细胞的特异性结合量，分析化合物对125I标记的TNF-α与L929细胞表面的TNF-α受体结合的影响;　　 4、MTT法分析TNF-α介导的L929细胞毒活性;　　 5、双荧光素酶报告基因法和Western blot法检测TNF-α刺激的293细胞和bEnd.3小鼠血管内皮细胞的NF-κB通路的活化;　　 6、Real-time PCR法分析TNF-α刺激的bEnd.3小鼠血管内皮细胞趋化因子和粘附分子的表达;　　 7、D-GalN/TNF-α联合诱导的小鼠急性肝损伤模型评价XFH-31的体内抗炎作用。　　 [研究结果]:　　 1、XFH-31可与TNF-α直接结合，选择性地抑制TNF-α与TNFR1的相互作用，阻断TNFR1介导的信号，在体内和体外拮抗TNF-α的促炎活性。　　 (1) Biacore分析结果再次确认XFH-31可与TNF-α直接结合，KD=7.02μM;　　 (2)凝胶过滤和非变性凝胶电泳表明XFH-31不会导致TNF-α三聚体解聚，但是TNF-α与系列浓度的XFH-31孵育后进行非变性凝胶电泳，发现TNF-α三聚体的主带明显变宽，提示XFH-31与TNF-α的结合可能会引起TNF-α的构象变化。XFH-31的存在使TNF-α的圆二色谱发生微小但明显可见的变化，这一结果确认了XFH-31可使TNF-α的二级结构发生细微的变化;　　 (3) XFH-31在2.5-10μM浓度内能以剂量依赖的方式抑制TNF-α与TNFR1的结合，而对TNF-α与TNFR2的结合仅具有较弱的抑制作用;　　 (4) XFH-31在2.5-10μM浓度内能以剂量依赖的方式抑制TNF-α杀伤L929细胞的活性和125I标记的TNF-α与L929细胞膜受体的结合;　　 (5)双荧光素酶报告基因法的检测结果发现XFH-31在2.5-10μM剂量范围内能以剂量依赖的方式抑制TNF-α刺激的293细胞内NF-κB报告基因的表达，但对IL-1刺激的NF-κB报告基因的表达基本无影响;Western blot结果进一步表明XFH-31能剂量依赖性地抑制TNF-α刺激所引起的IκBα磷酸化和降解，但对IL-1刺激所引起的IκBα磷酸化和降解则无显著影响;　　 (6) XFH-31在2.5-10μM剂量范围内能以剂量依赖的方式抑制TNF-α刺激的bEnd.3小鼠血管内皮细胞MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的表达，阻断TNF-α活化的NF-κB和MAPKs(p38，JNK和ERK)信号通路;　　 (7)在D-GalN/TNF-α联合诱导的小鼠急性肝损伤模型中，与模型组比较，XFH-31治疗组（8 mg/kg，i.p.）小鼠死亡率和血清ALT水平明显降低，肝细胞凋亡明显减少，肝组织内趋化因子MCP-1和MCP-2及粘附分子VCAM-1和ICAM-1的表达明显降低，提示XFH-31通过有效地抑制TNFR1介导的肝毒和炎症应答反应发挥其疗效，减轻TNF-α联合D-GaLN诱导的急性肝损伤。　　 2、多种旋覆花来源的XFH-31的结构类似物能与TNF-α直接结合，选择性地抑制TNF-α与TNFR1的相互作用，并在体外拮抗TNF-α的细胞毒活性。　　 (1)从37个旋覆花来源的倍半萜内酯中筛选出13个能有效抑制TNF-α杀伤L929细胞的活性，同时单独对L929细胞的存活或增殖无直接影响;　　 (2)上述13个倍半萜内酯中有10个化合物（XFH-31、TX-79、TX-109、XY-32、TX-69、XY-56、TX-65、TX-91、XY-34和XY-48）可以有效抑制TNF-α与TNFR1的相互作用，其中6个化合物对TNF-α与TNFR1结合的抑制活性明显比其对TNF-α与TNFR2结合的抑制活性强;　　 (3)进一步的Biacore分析发现6个倍半萜内酯(TX-79、TX-91、TX-109、XY-15、XY-27和XY-32)可与TNF-α直接结合，其中5个是倍半萜内酯二聚体。　　 [结论]:　　 从旋覆花中分离得到的新的倍半萜内酯二聚体XFH-31可与TNF-α直接结合，选择性地抑制TNF-α与TNFR1的相互作用，在TNF-α刺激的细胞中有效地阻断TNFR1介导的信号，在体内和体外拮抗TNF-α的促炎活性。其他XFH-31的结构类似物也能直接靶向TNF-α，选择性地抑制TNF-α与TNFR1的结合，并拮抗TNF-α的活性。这些新发现不仅拓宽了我们对该药用植物抗炎活性的分子机制的理解，也为进一步将这些化合物发展成为用于抗炎的新的小分子TNF-α拮抗剂奠定了实验基础。