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背景淋巴转移是胃癌转移的主要途径之一,也是影响术后复发及患者生存率的重要因素,有研究发现,在发生淋巴结转移的肿瘤中,常有淋巴管的增生和扩张,表明淋巴管生成在肿瘤淋巴转移过程中起着不容忽视的作用。导师魏品康教授积数十年临床经验,在总结前人理论基础上,构建胃癌“痰证学说”,认为“痰”是肿瘤发生、发展、转移的关键物质基础,因此提出“消痰散结”作为胃癌的核心治则,创立“消痰散结方”并应用于临床,取得了明显疗效。我科前期研究发现消痰散结方通过多靶点,多途径抑制肿瘤增殖,预防肿瘤复发、转移,但该方对于胃癌淋巴转移这一重要转移途径研究尚未深入,故本课题在前期研究的基础上,通过复制裸鼠人胃癌MKN-45原位移植模型,观察消痰散结方对胃癌淋巴管生长因子表达的影响,进一步探讨消痰散结方在防治胃癌淋巴转移方面的作用机理。目的通过复制建立裸鼠人胃癌MKN-45原位移植瘤模型,观察肿瘤生长、转移情况,计算抑瘤率,并通过运用EnVision、RT-PCR等方法,检测消痰散结方对肿瘤组织中VEGF-C,VEGF-D和VEGFR-3蛋白和mRNA表达的调控作用,探讨消痰散结方在防治肿瘤淋巴转移方面的作用机制。方法1.选取经传代后生长良好的人胃癌MKN-45细胞瘤株,将其移植到BALB／C裸小鼠胃大弯近胃窦旁,建立裸鼠人胃癌移植瘤模型。定期观察裸鼠全身情况和腹部瘤块生长特征,待动物出现衰竭征象时处死,解剖观察移植瘤局部生长情况。2.40只BALB／C雄性裸小鼠,采用随机数字表法分为：生理盐水组、5-Fu组、榄香烯组和消痰散结方组,术后48h后给予不同的干预：分别给予生理盐水0.4ml灌胃,1／日；5-Fu稀释液0.2ml腹腔注射(60mg.kg-1.w-1),1／周×3周：榄香烯稀释液0.4ml (2.5mg/ml)灌胃,1／日；消痰散结方0.4ml灌胃,1／日；给药时间为期6周,定期观察裸鼠全身情况、体重变化和腹部体征。3.第6周实验结束时,麻醉后牺牲、解剖实验动物,观察移植瘤局部生长情况及周围组织转移情况,剥取瘤组织,称取瘤重,计算抑瘤率。行HE染色,对肿瘤进行病理诊断。4.取瘤组织,行EnVision免疫组化方法,半定量分析和比较肿瘤组织VEGF-C,VEGF-D和VEGFR-3蛋白的表达,计数LMVD,分析肿瘤微淋巴管生成的情况。5.取瘤组织抽提总mRNA,逆转录合成cDNA行RT-PCR检测,从mRNA水平检测和比较VEGF-C,VEGF-D和VEGFR-3 mRNA的表达变化。结果1.成功建立裸鼠人胃癌MKN-45原位移植瘤模型。移植术后10天左右左上腹部可扪及直径约为5mm左右质地较硬的结节,随后结节逐渐增大,6周时部分荷瘤鼠出现消瘦、行动迟缓等衰竭症状,原位移植瘤突起于腹壁,质硬,部分动物瘤体突出至皮下,瘤块透壁可见,解剖后可见胃壁上有灰白色鱼肉状的肿瘤组织,呈实质性,膨胀性生长,有包膜,表面多呈椭圆形结节状,高低不平,质地较硬,粘膜下有血管走行,胃被包绕在瘤块中。部分原位瘤与肝、脾及腹壁粘连。裸鼠移植瘤原位成瘤率100%,HE染色证实为低分化腺癌。2.各组动物均可观察到腹腔淋巴结肿大,其中5-Fu组,榄香烯组,消痰散结方组出现淋巴结转移比率分别为60%,40%,40%,明显低于生理盐水组90%。3.消痰散结方对MKN-45荷瘤小鼠肿瘤生长抑制情况表明：5-Fu组,榄香烯组,消痰散结方组的抑瘤率分别为66.5%、51.0%,57.1%。5-Fu组,榄香烯组,消痰散结方组的平均瘤重明显小于生理盐水组(P<0.01)；消痰散结方组平均瘤重与5-Fu组,榄香烯组相比差异无统计学意义(P>0.05),5-Fu组平均瘤重与榄香烯组相比差异有统计学意义(P<0.05)。4.消痰散结方对移植瘤组织中VEGF-C蛋白及mRNA表达的影响：(1)消痰散结方对移植瘤组织中VEGF-C蛋白表达的影响：与生理盐水组相比,消痰散结方组、5-Fu组、榄香烯组均可明显降低VEGF-C的阳性表达(P<0.01),三组药物之间互相比较：消痰散结方组与榄香烯组相比,差异有统计学意义(P<0.05)；消痰散结方组、榄香烯组与5-Fu组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)消痰散结方对移植瘤组织中VEGF-C mRNA表达的影响：在VEGF-C mRNA的表达上消痰散结方组、5-Fu组、榄香烯组的cDNA扩增条带面积灰度值均较生理盐水组明显下调,(P<0.05),三组药物之间互相比较差异均无统计学意义(P>0.05)。5.消痰散结方对移植瘤组织中VEGF-D蛋白及mRNA表达的影响：(1)消痰散结方对移植瘤组织中VEGF-D蛋白表达的影响：与生理盐水组相比,消痰散结方组、5-Fu组、榄香烯组均可明显降低VEGF-D的阳性表达(P<0.01),三组药物之间互相比较差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)消痰散结方对移植瘤组织中VEGF-D mRNA表达的影响：在VEGF-D mRNA的表达上消痰散结方组、5-Fu组、榄香烯组的cDNA扩增条带面积灰度值均较生理盐水组明显下调,(P<0.05),三组药物之间互相比较差异均无统计学意义(P>0.05)。6.消痰散结方对移植瘤组织中VEGFR-3蛋白及mRNA表达的影响：(1)消痰散结方对移植瘤组织中VEGFR-3蛋白表达的影响：与生理盐水组相比,消痰散结方组、5-Fu组、榄香烯组均可降低VEGF-3的阳性表达(P<0.05),消痰散结方组与5-Fu组、榄香烯组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)消痰散结方对移植瘤组织中VEGFR-3 mRNA表达的影响：在VEGFR-3 mRNA的表达上消痰散结方组、5-Fu组、榄香烯组的cDNA扩增条带面积灰度值均较生理盐水组明显下调(P<0.05),三组药物之间互相比较差异均无统计学意义(P>0.05)7.消痰散结方对移植瘤组织中微淋巴管密度的影响：各组LMVD值计数分别为生理盐水组17.43±1.79,5-Fu组13.33±2.71,榄香烯组10.20±3.64,消痰散结方组12.23±3.21,与生理盐水组相比较,消痰散结方组、5-Fu组、榄香烯组均可明显降低移植瘤组织中的微淋巴管密度(P<0.05),三组药物之间互相比较：消痰散结方组与5-Fu组、榄香烯组相比差异均无统计学意义(P>0.05)结论：1.消痰散结方对裸鼠人胃癌MKN-45原位移植瘤增殖和转移具有明显抑制作用；2.消痰散结方可明显降低移植瘤组织中微淋巴管密度,可能是其抑制肿瘤淋巴转移的作用途径；3.消痰散结方能够不同程度地下调淋巴管生长因子VEGF-C、VEGF-D及其受体在蛋白水平和mRNA水平的表达,可能是其抑制肿瘤淋巴转移的分子生物学机制。