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基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs),是由一系列可以降解细胞外基质的水解酶组成的超家族,因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名。它参与了人体内许多重要的生理功能,包括组织重塑,伤口修复,骨骼生长和胚胎发育等。迄今为止,在人体内共发现26种MMPs,根据其底物特异性,大致可分为6组:胶原酶、明胶酶、间质降解素、基质溶解素、膜型MMP和其他分泌型MMP。在2000年MMP-26最先在人的子宫内膜癌细胞中克隆得到并被鉴定。相较于其他MMPs,MMP-26的结构更简单,只包括信号肽(1-17),前肽(18-89)和催化结构域(90-261),全长为261个氨基酸。在其前肽结构域中包含一个特殊的“半胱氨酸开关”,PH81CGVPDGSD,其他MMPs成员在这个位点为精氨酸,这提示我们MMP-26的酶原激活方式可能与众不同。在MMPs家族中,MMP-26与MMP-7的序列同源度为39%,是与其他MMPs相比相对较高的,MMP-26与MMP-7同属基质溶解素亚家族,但是它们之间有诸多不同的性质。例如,MMP-7是一种典型的分泌型蛋白,通过与细胞膜上的胆固醇硫酸盐相偶联而定位于细胞膜,能够降解纤维链接蛋白,层粘连蛋白和凝胶蛋白。MMP-26具有功能与MMP-7相似的信号肽,但是有证据表明MMP-26主要在乳腺癌细胞,前列腺癌细胞内部表达,并且在上清液没有检测到MMP-26的存在。这提示我们MMP-26与MMP-7相比有不一样的细胞亚定位机制。根据我们实验室王智勇博士的研究结果,他的论文首次报道了MMP-26定位于细胞的内质网上,其80-125位氨基酸决定MMP-26具有这种特异性定位的功能。在本论文中我们通过重叠延伸PCR的方法,构建MMP-26的截短型突变体,通过免疫荧光实验将MMP-26定位内质网的关键序列确定为其88-123位氨基酸。随后我们将这一段具有特殊功能的序列替换给了MMP-7序列上的相应位置,发现构建成功的MMP-7的突变体也能够定位于内质网。这说明MMP-26的88-123位氨基酸是一个非“KDEL”式的内质网滞留信号。在对MMP-26-GFP进行Western blot实验时,我们发现其分子量远大于理论值,因此我们推测MMP-26有存在N-糖基化修饰的可能性。为了验证这一猜想,我们利用衣霉素和外切糖苷酶抑制了MMP-26可能存在的N-糖基化修饰,随后的Western Blot结果证明经过这样的处理后,分子量确实与理论值相近。我们进一步采用定点突变的方法将MMP-26的2个潜在的N-糖基化位点突变成丙氨酸,随后的Western Blot结果也证实了我们的推断,确定第64位和第221位是它的两个N-糖基化位点。同时,将MMP-26突变体转染至细胞中,细胞荧光结果显示N-糖基化的缺失并没有影响MMP-26的内质网定位。这个结果与我们上一阶段的实验结论不谋而合。根据我们实验室张金瑞博士的研究结果,MMP-26与内质网分子伴侣蛋白GRP78共定位于内质网,并且存在蛋白质之间的相互作用,MMP-26能够下调细胞内GRP78的蛋白表达水平。本篇论文进一步证明N-糖基化修饰对于二者之间的相互作用有很大的影响。我们想探究MMP-26在细胞中与GRP78相互作用和调控机制。因此我们构建了稳定低表达和过表达MMP-26的He La细胞系。我们首先研究MMP-26在He La细胞内的表达差异对He La细胞的生物学行为有何影响。我们发现过表达MMP-26的He La细胞的增殖和侵袭能力都受到了一定的影响。我们发现当MMP-26表达量很高时,PI3K和AKT的磷酸化水平会随着GRP78表达的下调而下调,细胞的增殖和侵袭活性降低可能与此有关。GRP78是典型的内质网稳态蛋白,因此我们检验了其下游的三个未折叠蛋白效应蛋白,IRE1,PERK和ATF6的表达量,我们发现PERK的表达量会随之上升,并且我们检测到CHOP蛋白的表达量也会上升,这是细胞凋亡通路的一个关键蛋白。这说明,MMP-26可能具有促进He La细胞凋亡的功能。综上所述,本论文证明了MMP-26定位内质网的关键序列是其88-123位氨基酸,这是一个非“KDEL”式的内质网定位信号,同时证明了MMP-26存在N-糖基化修饰,有两个N-糖基化位点(N64,N221),N-糖基化的抑制并不影响它内质网定位的特性,但会影响它与GRP78的相互作用。本论文验证了MMP-26能够降低细胞内GRP78的表达水平,并降低PI3K和AKT的磷酸化水平,从而降低He La细胞的增殖能力和侵袭能力,并上调未折叠蛋白效应中促凋亡蛋白CHOP的表达水平,促进He La细胞的凋亡。我们的研究为探索MMP-26在细胞内的特殊功能提供了坚实的基础。