第一部分：大鼠尾椎纤维环穿刺法建立椎间盘退变模型的研究　　 研究背景：　　 下腰痛(Low Back Pain)是现代社会中极为常见的疾患，80％以上的人一生中曾有过下腰痛的经历，给社会和家庭均造成了沉重的负担。下腰痛病因复杂，其中椎间盘退变(Intervertebral Disc Degeneration,IDD)及其继发的一系列疾病，如腰椎间盘突出症、椎间盘源性疼痛、腰椎管狭窄症及退变性腰椎滑脱症等被公认为是导致下腰痛的主要原因。我国人口众多且社会老龄化逐年加剧，对腰腿痛病人的诊治、康复及由此引起的劳动力丧失给全社会带来了沉重的负担，导致了众多患者生活质量的严重下降；重视椎间盘退变性疾病的基础与临床研究具有十分重要的现实意义。近年众多学者提出了各种以逆转或再生退变椎间盘为目的的生物治疗方法，包括基因治疗、细胞移植、生长因子直接注射等。而无论是评价与筛选各种新型生物治疗手段的效果，还是深入研究椎间盘退变的病理生理机制，选择与构建合适的动物模型都具有十分重要的意义，是进行椎间盘方面研究的基础。　　 大鼠等啮齿类动物以其易于获得、适合多种实验目的、可耐受手术创伤、饲养方便且成本较低的优点，在众多研究中得到了广泛应用，是最常用的椎间盘退变动物模型之一。既往研究中多采用特殊的机械持续加压装置改变大鼠脊柱生物力学环境的方法来达到引起椎间盘退变的目的，但操作复杂，不适合较多数量的筛查实验。而直接利用穿刺针损伤纤维环的办法具有操作微创、可控性与可重复性好的优点，已在兔、羊、猪等多种动物模型中得到广泛应用，但用于大鼠尾椎这一特殊解剖部位的研究尚刚刚起步。　　 目的：　　 建立一种操作简便、效果可靠的大鼠尾椎椎间盘退变模型，同时也为下一部分的课题提供退变的尾椎间盘髓核组织。　　 方法：　　 定位大鼠尾椎的Co4/5及Co8/9椎间隙，无菌条件下分别做一个长度约0.5cm的小切口，切开皮肤、皮下组织直接显露白色的椎间盘，然后用21 G的注射器针头平行于终板刺入纤维环，深度以尖端夹持的血管钳控制在3mm。刺入后缓慢旋转360度，再停留约30秒钟后拔出。3-0丝线缝合皮肤。术后2周应用X线、MRI及组织学(苏木素-伊红)染色观察评估退变发生情况。　　 结果：　　 穿刺手术后2周，与空白对照及假手术组椎间盘相比，在X线片上穿刺椎间隙高度指数并没有发生明显变化(P=0.246)。术后尾椎MRI显示，在T2加权像上，无论是与未手术的相邻节段还是与其它对照组椎间盘相比，穿刺后的椎间盘信号强度都明显降低。各组动物的Pfirrmann分级差异明显，空白对照组椎间盘基本均属完全正常的Ⅰ级表现，假手术组有少数椎间盘稍有退变改变，而穿刺组各个节段都发生了明显的改变，其中Pfirrmann分级Ⅲ级表现最多，有6个，Ⅱ级与Ⅳ级表现各为2个椎间盘，但没有出现非常严重退变的Ⅴ级表现。苏木素-伊红染色发现：对照组及假手术组大鼠尾椎椎间盘内结构比较完整，髓核与纤维环分界清楚，椭圆形髓核组织占据了整个尾椎间盘面积2/3以上的区域，排列较紧密的髓核细胞分布较均匀；纤维环结构齐整、排列规则，各层纤维软骨板呈同心圆状分布，无裂痕，成纤维细胞间断分布其间。而在穿刺后2周的椎间盘呈较为明显的退变性改变，即髓核组织面积逐渐缩小，约占整个椎间盘区域的一半以下，与纤维环之间的连续性中断、空隙增宽；髓核细胞尽管仍是软骨细胞样外观，但数目减少，出现明显的空泡样变性，着色稍淡，细胞外基质分散，部分髓核被纤维样物质所取代。纤维环失去了规整的同心圆结构，排列紊乱，出现明显的向心性裂隙，颜色稍淡染，纤维环中成纤维细胞减少而类软骨样细胞分布增多。各组中的上下终板染色没有发现明显区别。　　 结论：　　 大鼠尾椎椎间盘易于显露，操作方便，是建立椎间盘退变动物模型的一个较好选择。采用21 G穿刺针进行纤维环穿刺的方法在术后2周可以引起明确的椎间盘退变改变。　　 第二部分：大鼠正常与退变性髓核突出诱致神经根性疼痛的对比及其机制研究　　 研究背景：　　 腰椎间盘退变及其继发的系列病理改变是引起患者腰腿痛的主要原因。椎间盘退变方面的基础研究是脊柱外科领域的关注热点，如探讨退变的病理生理机制、以修复或再生退变椎间盘为目的的各种生物治疗等近年来得到了广泛研究。从临床角度出发，深入研究腰腿痛的发生机制与椎间盘退变之间的联系具有十分重要的意义。对椎间盘退变各种动物模型的建立以及生物治疗方法的验证等只有考虑到与疼痛相联系时才更具实际意义。　　 鉴于人类感知疼痛的复杂性与主观性，决定了很难利用动物模型来精确模拟和评价评价腰痛这样的轴性痛，因此目前在疼痛方面的研究多利用了实验性椎间盘髓核突出或其他机械因素压迫引起的神经根性疼痛模型来代替，以模拟临床上最常见的腰椎间盘退变性疾病——腰椎间盘突出症的发生。近年来大量研究表明：除机械压迫因素外，与椎间盘髓核有关的炎性化学因子所造成的刺激，是引起神经功能受损害或产生疼痛的重要原因。但既往这些研究都是直接利用自体或者是异体的髓核组织进行移植，而在临床上，绝大部分腰椎间盘突出症的患者都伴有明显的退变改变，表现为MRI上信号降低或“黑盘征”。已发生退变的椎间盘组织与正常的椎间盘无论是在形态结构、生化成分还是在多种细胞因子含量等方面都有明显差异，因此，有必要利用退变性髓核突出导致神经根性疼痛的模型来研究椎间盘退变与疼痛之间的关系并进行机制方面的探讨。　　 目的：　　 探讨大鼠正常与退变性髓核突出诱致神经根性疼痛的不同，研究椎间盘退变与神经根性疼痛之间的关系；探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及其受体(TNFR1及TNFR2)在疼痛进展过程中的作用。　　 方法：　　 利用尾椎椎间盘纤维环穿刺的方法建立椎间盘退变模型后，分别取出自体的退变髓核与正常髓核组织，置于手术显露后的腰5左侧神经根处，建立髓核突出导致神经根性疼痛模型。分别在术后1，4，7，10，14和21天采用行为学测试的方法检测两组大鼠的运动功能、机械刺激阈值与热刺激阈值；分别在术后第4与14天采用免疫组化的方法检测两组的腰5左侧背根神经节中TNF-α的表达。在退变性髓核突出导致神经根疼痛模型后，分别在术后1，4，7，10，14和21天采用蛋白免疫印迹(Western Blot)检测背根神经节中TNFR1和TNFR2的表达变化。　　 结果：　　 所有4组实验动物手术前后均没有出现跛行、步态异常或瘫痪的现象，运动损害功能评分为0分。对照组和假手术组动物没有出现明显的机械痛觉过敏现象；而无论是正常还是退变髓核移植组大鼠都出现了手术侧(同侧)后肢的机械刺激阈值明显降低-逐渐恢复的一个过程，且痛觉过敏的现象一直持续到术后第10～14天之间结束。同时，通过对术后某一时间点的组间对比发现，在手术后的第1、4、7天，移植退变髓核的N-NP组大鼠机械性阈值比P-NP组更低(P值分别为0.038，0.021和0.038，均＜0.05)，表明该组的机械性痛觉过敏程度更重。手术对侧尽管在特定的时间点也有疼痛过敏的发生，没有发现规律性的变化过程。与机械性刺激的结果不同，术后的热刺激阈值没有呈现规律性变化。与手术前相比，在手术侧仅有下列时间点存在统计学差异：P-NP组：手术后1天(P=0.017)；N-NP组：手术后第4天(P=0.025)与第10天(P=0.042)。手术对侧没有发现明显的阂值降低。对照组和假手术组切片阳性染色很少。相比之下，两种髓核移植组在术后第4及14天都观察到了DRG中TNF-α表达量的显著升高，强阳性染色主要位于神经元胞浆，分布比较均匀；间质细胞也有部分阳性表现。计数切片显微镜视野内阳性染色细胞的数目并做比较发现，N-NP组与P-NP组之间相比，阳性细胞数目在两个时间点都没有发现显著性差异(第4天P=0.252，第14天P=0.146)。对退变性髓核移植组DRG中两种TNFR蛋白的表达研究发现，TNFR-1在术后早中期持续维持在较高水平(10 d内)，与疼痛过敏进程相关；而TNFR-2除在术后的早期(1 d)有高表达外，还在痛觉过敏恢复后(14 d、21 d)有高表达。　　 结论：　　 1.大鼠自体尾椎椎间盘髓核移植到腰5神经根可以引起明显的机械性痛觉过敏现象发生。　　 2.与正常髓核组织相比，发生退变的髓核组织移植会在一定时期内导致神经根性疼痛程度的加重。　　 3.背根神经节内的TNF-α表达在髓核移植导致神经根性疼痛的病理生理过程中可能发挥了重要作用；其不同类型的受体TNFR1和TNFR2在疼痛进展中的角色不同，TNFR1与机械性痛觉过敏的进程相关；而TNFR2主要与炎症反应后的神经修复或再生有关。