【摘 要】
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目的:探究精子相关抗原6（SPAG6）对卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响及其调控机制。方法:RT-q PCR法检测人正常卵巢上皮细胞NOE-71和人卵巢上皮癌细胞OVCAR-3、SKOV-3细胞中SPAG6基因的表达。将4种潜在抑制SPAG6基因表达的“SPAG6-sh RNA”质粒转染至SKOV-3细胞中,RT-q PCR和Western blot实验筛选有效抑制SPAG6基因表达的细胞株。通过平板克
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目的:探究精子相关抗原6（SPAG6）对卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响及其调控机制。方法:RT-q PCR法检测人正常卵巢上皮细胞NOE-71和人卵巢上皮癌细胞OVCAR-3、SKOV-3细胞中SPAG6基因的表达。将4种潜在抑制SPAG6基因表达的“SPAG6-sh RNA”质粒转染至SKOV-3细胞中,RT-q PCR和Western blot实验筛选有效抑制SPAG6基因表达的细胞株。通过平板克隆、细胞生长实验、细胞划痕实验、Transwell实验等检测抑制SPAG6基因表达对SKOV-3细胞的增殖、迁移以及侵袭能力的影响。采用免疫荧光和Western blot观察对照组和SPAG6表达抑制组细胞中细胞周期调控蛋白p27kip1的表达与定位。将p27kip1表达质粒“p EGFPN2-p27kip1”和SPAG6表达质粒“p En MCV-SPAG6”共转染至HEK293T细胞,免疫荧光观察SPAG6和p27kip1蛋白在细胞中的定位,分析SPAG6对细胞内p27kip1定位的影响。Western blot法检测对照组和SPAG6表达抑制组细胞中PTEN、p-AKT、p-Thr157-p27kip1、Caspase-9、cleaved Caspase-3等蛋白的表达水平;用PI3K抑制剂处理上述两组细胞,Western blot检测细胞中SPAG6、PTEN、p-AKT、p-Thr157-p27kip1、cleaved Caspase-3等蛋白的表达水平。结果:SPAG6 m RNA在卵巢癌细胞SKOV-3和OVCAR-3中的表达均显著高于正常卵巢上皮细胞NOE-71,且在SKOV-3细胞中表达最强,因此后续主要用SKOV-3细胞开展实验。RT-q PCR和Western blot结果显示“SPAG6-sh3”和“SPAG6-sh4”组SKOV-3细胞中SPAG6表达抑制的效率最高。与对照组细胞相比,抑制SPAG6表达显著降低SKOV-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力（P＜0.01）。免疫荧光和Western blot结果显示p27kip1在SKOV-3细胞的细胞浆中高表达;抑制SPAG6表达后p27kip1却在细胞核中高表达。在单独转染p27kip1表达质粒的HEK293T细胞中,p27kip1于细胞核中高表达而细胞浆中几乎未见表达;当SPAG6与p27kip1表达质粒共转染时,p27kip1除了在细胞核中有表达之外,在细胞浆中也有丰富表达。Western blot实验结果显示,与对照组细胞相比,“SPAG6-sh3”和“SPAG6-sh4”组SKOV-3细胞中PTEN、Caspase-9、cleaved Caspase-3的表达水平升高,p-AKT和p-Thr157-p27kip1的表达水平降低,且差异具有统计学意义（P＜0.01）。对照组SKOV-3细胞和“SPAG6-sh4”组细胞加入PI3K抑制剂后,SPAG6表达无变化,而PTEN、cleaved Caspase-3蛋白表达进一步升高,p-AKT、p-Thr157-p27kip1蛋白表达进一步降低（P＜0.05）。结论:SPAG6低表达能降低卵巢癌细胞SKOV-3的增殖、生长、迁移以及侵袭能力;在卵巢癌细胞SKOV-3中,SPAG6能介导p27kip1的胞浆定位,同时通过PTEN/PI3K/AKT信号通路介导p27kip1蛋白氨基酸位点Thr157发生磷酸化和抑制细胞凋亡来影响SKOV-3细胞的增殖。
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