1研究背景百草枯(Paraquat,PQ)中毒近年来发病呈上升趋势,发病率在农药中毒事件中仅次于有机磷农药中毒,但由于百草枯中毒救治是迄今仍未解决的医疗难题,其病死率在农药中毒事件中居第一位。目前,在特效解毒药缺如的情况下临床救治集中在两大方面:药物减轻肺损伤和清除毒物。药物救治主要集中在三方面:激素、免疫抑制剂及抗氧化剂,基于对百草枯毒理机制的认识,抗氧化剂应用在百草枯中毒药物救治中占据重要地位,但目前在用抗氧化剂未取得满意临床疗效。3-巯基丙酮酸衍生物(DZ01)作为非蛋白类巯基供体能够有效减轻肺损伤性毒剂吸入所致肺损伤,辅酶Q10(Coenzyme Q10,CoQ10)作为一种脂溶性抗氧化剂临床上广泛应用于心血管系统疾病,据此拟通过动物实验初步探究DZ01与CoQ10作为抗氧化剂应用于百草枯中毒救治的可行性。临床上毒物清除主要集中在胃肠道清除和血液净化清除两方面,针对靶器官——肺组织内毒物的清除尚未见研究,大容量全肺灌洗术(Whole lung lavage,WLL)是临床用于清除肺内致病因子的成熟技术,拟基于此初步探究WLL对肺组织内百草枯清除的可行性。2研究目的从抗氧化剂药物应用与靶器官毒物清除两方面着手,分别以组织相关氧化还原指标变化和相关样品中百草枯含量变化趋势等数据为评价指标,分步探究潜在抗氧化剂(DZ01、CoQ10)及WLL对百草枯中毒救治应用的可行性,以期为临床救治百草枯中毒提供新方法。3研究方法3.1抗氧化剂(DZ01、CoQ10)对百草枯中毒救治的初步研究实验选择临床上广泛使用的N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)为阳性对照药。将160只体重18~20gSPF级健康雄性CD-1(ICR)小鼠(许可证号:SCXK(京)2012-0001),随机分为两组:存活率观察组64只、肺损伤评价组96只,每组再随机均分为8个亚组:正常对照组(N-C)、PQ对照组(PQ-C)、CoQ10预防组(CoQ10-P)、CoQ10治疗组(CoQ10-T)、NAC预防组(NAC-P)、nac治疗组(nac-t)、dz01预防组(dz01-p)、dz01治疗组(dz01-t)。n-c组给予腹腔注射生理盐水(0.1ml/10gbw)两次,间隔1h;其余各组给予腹腔注射pq(50mg/kg,0.1ml/10gbw)染毒,其中pq-c组间隔1h后腹腔注射生理盐水(0.1ml/10gbw),预防给药组于染毒前30min给药,治疗给药组于染毒后1h给药,给药途径与剂量分别为:coq10(尾静脉注射,0.125ml/20gbw)、nac(腹腔注射,150mg/kg,0.1ml/10gbw)、dz01(腹腔注射,517mg/kg,0.1ml/10gbw)。存活率观察组观察并记录各亚组小鼠7天内一般状况、体重变化及死亡情况。肺损伤评价组于染毒后48h对各亚组奇数编号小鼠行肺泡灌洗,测定支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,balf)中蛋白含量;偶数编号小鼠取全肺,称湿重后制备10%肺组织匀浆,利用试剂盒并严格按照操作说明书测定肺组织中总超氧化物歧化酶(totalsuperoxidedismutase,t-sod)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(gluthathioneperoxidase,gsh-px)活性、谷胱甘肽(glutathione,gsh)含量、丙二醛(malondialdehyde,mda)含量。利用originpro软件处理数据,所得定量资料以“均值±标准差”形式记录,组间比较采用单因素方差分析,生存分析采用logrank检验,p<0.05为差异有统计学意义。3.2wll对肺组织内百草枯清除作用的探究72只体重180~200g健康雄性wistar大鼠(许可证号:scxk(京)2012-0001),随机区组法均分为12组,依据染毒后行wll时间点命名为:0h组(即不染毒)、1h组、3h组、6h组、9h组、12h组、15h组、18h组、24h组、48h组、72h组、168h组,1h组~168h组给予经口灌胃1次染毒,pq剂量60mg/kg;于相应时间点采血后模拟行离体肺组织左侧全肺叶灌洗术:“3ml生理盐水,注入——回抽循环3次”为一次灌洗,共进行三次灌洗,即灌洗总量9ml,回收三次灌洗液分开保存。左、右侧肺组织分别制备成10%肺组织匀浆。采用表面增强拉曼光谱(surface-enhancedramanspectroscopy,sers)法检测所得血浆、灌洗液、组织匀浆样本中百草枯含量。利用originpro软件处理数据,所得定量资料以“均值±标准差”形式记录,组间比较采用单因素方差分析,p<0.05为差异有统计学意义。4研究结果4.1dz01、coq10对百草枯中毒救治的初步研究结果4.1.1存活率观察结果各染毒组存活率明显低于n-c组(p<0.01),抗氧化剂干预组中dz01-p组和dz01-t组存活率高于pq-c组,dz01-p组中位生存时间延长,但差异均无统计学意义(p>0.05);coq10与nac预防及治疗给药对pq染毒小鼠存活率无改善。4.1.2肺损伤评价研究结果pq-c组与n-c组相比肺系数、balf蛋白含量、mda含量均明显升高(p值分别为0.001、0.0009、0.02),t-sod活性、gsh-px活性、gsh含量均下降,但差异不明显(p>0.05)。dz01-p组与pq-c组相比:肺系数与balf中蛋白含量下降,gsh含量与t-sod活性升高,但差异均不明显(p>0.05);mda含量下降明显(p=0.0001)。dz01-t组与pq-c组相比:balf中蛋白含量与mda含量下降明显(p值分别为0.01、0.003);肺系数下降与gsh含量上升均不明显(p>0.05)。coq10-p组及coq10-t组与pq-c组相比:肺系数、balf中蛋白含量及mda含量降低,gsh含量升高,但差异均无统计学意义(p>0.05)。dz01-p组与nac-p组相比mda含量下降明显(p=0.018),其余指标差异不明显(p>0.05)。dz01t组与nac-t组相比balf中蛋白含量下降明显(p=0.007),其余指标差异不明显(p>0.05)。4.2wll对肺组织内百草枯清除作用研究结果4.2.1肺泡灌洗液中百草枯含量变化各染毒组3次肺泡灌洗液中均检测到百草枯,染毒后1h、3h、6h组肺泡灌洗液中检测到高浓度的百草枯(第1次肺泡灌洗液中百草枯浓度分别为1573.9±310.13ng/ml、994.6±147.28ng/ml、322.4±47.17ng/ml),与后续各组相比差异明显(p<0.01);后续各组间肺泡灌洗液中百草枯含量相比15h组、18h组高于其余组,但差异不明显(p>0.05)。4.2.2双侧肺组织中百草枯含量变化各时间点左侧肺组织(灌洗侧)内百草枯含量低于右侧肺组织(非灌洗侧),差异明显(p<0.01)。肺组织内百草枯浓度于12h达峰值(13642.2±1242.66ng/g),是同时间点血浆的19.15倍。以“清除率=(右侧肺组织百草枯浓度-左侧肺组织百草枯浓度)/右侧肺组织百草枯浓度×100%”计算出大容量全肺灌洗术对肺组织内百草枯的清除率为(40±12.0)%。4.2.3血浆中百草枯含量变化1h组血浆中百草枯即达极高浓度(8926.3±1586.47ng/ml),与后续时间点差异明显(p<0.001),6h内百草枯浓度下降迅速(90%以上),24h内维持在较高浓度,到168h仍能检测到百草枯(3.0±0.72ng/ml)。5研究结论1、DZ01与CoQ10在本研究所予剂量下单次给药对百草枯染毒小鼠(腹腔注射,50mg/kg)7天生存率影响差异不显著(P>0.05);DZ01预防给药能延长染毒小鼠中位生存时间,但差异无统计学意义(P>0.05)。2、DZ01通过减轻百草枯中毒早期急性肺损伤及减弱百草枯中毒引起的脂质过氧化反应对抗百草枯毒性,有作为抗氧化剂应用于百草枯中毒救治的实验依据。3、CoQ10在本研究中所用剂型及剂量条件下对抗百草枯中毒氧化应激损伤效果不明显。4、染毒大鼠肺组织中百草枯含量变化趋势与人类肺组织相似度高,大鼠是研究靶器官治疗措施的良好动物模型。5、大容量全肺灌洗术能清除大鼠肺组织内的百草枯,清除率(40±12.0)%,染毒后1h清除量最多,15h为清除量第二高峰,168h内均可清除肺组织内一定量的百草枯,可作为清除肺组织内百草枯一项救治措施。