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猪产肉性状的遗传基础解析一直是猪遗传改良的重要研究内容。与产肉性状相关的大量QTL(quantitative trait locus)已被定位到猪不同染色体区域;涉及肌肉生长发育的基因的研究也越来越多,但对于候选基因的发掘和调控机制的认识还十分有限。连锁定位是寻找主效基因的有力工具,通过密集某个区域达到发现主效基因的目的;染色质免疫共沉淀是基于体内分析发展起来的方法,研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用,可以阐明基因的表达机制和发育的调控网络。
本课题组前期所研究的猪TEF-1,MYOD1和CSRP3基因均定位于2号染色体2p14-p17区段,且这个区段存在背膘厚日增重QTL,因此推断此区域有影响重要QTL的候选基因存在。本研究借鉴了比较基因组法筛选候选基因的思路,筛选与肌肉生长发育相关的基因,从基因的cDNA序列的克隆及特征分析、染色体定位、表达模式、基因的多态位点对猪产肉性状的影响、基因的连锁定位等方面出发对候选基因进行研究,并进一步研究了转录因子下游的靶基因,取得了如下主要结果:
1.在EST基础上,结合生物信息学与实验验证克隆获得了猪LDHA和COPB1基因的全长cDNA序列,分析了其结构特征,并提交到GenBank数据库,获得了GenBank登录号,LDHA(FJ865398),COPB1(FJ865397)。推导了两个基因的氨基酸序列,经结构预测发现:LDHA蛋白含有NADB-Rossman和1dh结构域;COPB1蛋白含有Adaptin_N和cotamer_beta_C结构域。
2.利用RT-PCR方法检测了LDHA和COPB1基因在通城成年猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、骨骼肌、胃、肠、脂肪等9个组织中的表达情况,结果发现这两个基因在大部分组织中均表达,且在骨骼肌中表达量较高。
3.利用辐射杂种板对LDHA和COPB1基因进行了染色体定位。定位结果表明这两基因均被定位于SSC2p14-p17,且对SSC2p14-p17区域的5个基因(MYOD1,LDHA,CSRP3,TEF-1,COPB1)的定位结果进行分析发现,其顺序可初步确定为MYOD1-LDHA-CSRP3-TEF-1-COPB1。在美国Rothichild教授构建的F2资源群体中对这5个基因进行了连锁定位,确定基因的顺序为MYOD1-LDHA-CSRP3-TEF-1-COPB1。
4.在我室与通城县畜牧局合建的试验群体和美国Rothichild教授构建的F2资源群体中对LDHA和COPB1基因多态与性状关联进行了分析,结果如下:
在我室与通城县畜牧局合建的试验群体中,对LDHA基因第6外显子A95G和COPB13’UTR C73T多态与性状进行关联分析,结果发现:LDHA多态位点与pH值存在显著相关(P<0.05),与肉色存在相关的趋势(P=0.0756);COPB1与臀部膘厚、三点平均膘厚和腿臀肉骨率存在显著相关,与肩膘存在相关的趋势(P=0.0538)。
在美国Rothichild教授构建的F2资源群体中进行LDHA基因第6外显子A95G和COPB13’UTR C73T多态与性状关联分析,发现LDHA基因多态与平均背膘厚、眼肌面积、胸腰椎接合处膘厚、大理石纹、第十肋骨处膘厚、测试期间平均日增重、滴水损失和Ⅱ型肌纤维比率存在显著相关(P<0.05);COPB1与平均背膘厚、屠体重、最后肋骨处膘厚达到显著性水平(P<0.05),与胸腰椎接合处膘厚、第十肋骨处膘厚存在极显著相关(P<0.01)。
5.运用ChIP-on-chip技术钓取了小鼠TEF-1转录因子在肌肉组织中的下游靶基因,并进行了GO分析和调控通路分析。筛选到了745个靶基因,512个在GO数据库中得到注释。大部分靶基因参与了转录调控相关的细胞生理过程,具有结合活性和催化活性,且位于细胞核内。靶基因主要参与了MAPK信号通路,T细胞受体信号通路和B细胞受体信号通路,这些通路均与细胞的增殖和分化等过程有关,表明所钓取的大部分基因在肌肉的生长发育过程中发挥了重要作用。
6.结合基因所参与的调控通路及其功能,筛选参与肌肉生长发育的候选靶基因FOXO3A进行验证,克隆FOXO3A基因的启动子,并进行转录因子结合位点预测,发现存在TEF-1转录因子的结合位点,另外还包含MEF2,E蛋白家族,myogenin结合位点,初步推断FOXO3A基因受TEF-1调控。
7.用PCR方法进行独立的ChIP分析,发现FOXO3A有富集;EMSA的结果也显示FOXO3A基因受TEF-1调控;然后构建FOXO3A基因启动子的正向和反向载体,插入pGL3-Basic载体,测定双荧光素酶的活性,发现正向和反向载体的活性差大于10倍,可以确定FOXO3A基因确实受TEF-1调控。
以上工作的完成为动物功能基因组和肌肉生长发育分子调控机制的研究积累了新的基础资料,为筛选猪的候选基因和分子标记提供了新的思路。