目的:抗菌肽PR39来源于猪小肠上皮细胞,属于cathelicidins家族抗菌肽,具有比较广谱、高效的抗菌作用,对革兰氏阳性菌、阴性菌以及真菌都具有很好的抑制效果。目前PR39的应用主要集中在畜牧业,作为饲料添加剂使用,能够有效地改善禽畜肠道功能以及增强机体的免疫力;PR39还能够作为促血管生长因子促进多种与血管生成有关的基因的表达,有利于对心血管疾病的研究。筛选高表达PR39工程菌是解决制约它在食品、药品等方面应用的关键问题。本实验运用合成生物学的原理,利用荧光蛋白为分子信标、顺式作用元件P2A作为Linker设计融合蛋白表达线路,以期筛选非甲醇诱导的高表达PR39抗菌肽的毕赤酵母工程菌。方法:(1)本实验设计了两条荧光蛋白与抗菌肽PR-39融合表达的基因线路;(2)利用合成生物学中的“生物积块”的克隆技术,构建荧光蛋白与抗菌肽PR39融合表达的表达盒;(3)电击转化毕赤酵母,再通过紫外诱变,以荧光蛋白为分子信标,筛选非甲醇诱导的高表达PR39毕赤酵母菌株。结果:(1)本实验成功构建了通过2A肽将绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白分别与PR39多拷贝进行融合表达的两条基因线路。(2)本实验所构建的重组PR39毕赤酵母工程菌G-PR39菌株表达水平为21.8mg/L,小于D-PR39菌株32.7mg/L的表达水平。经诱变筛选得到的D-PR39-Y菌株表达量为55.4 mg/L,相对于D-PR39提高了69.4%。表达产物经抑菌实验证明其对大肠杆菌和粪链球菌都具有抑菌活性,且对大肠杆菌的抑制作用高于对粪链球菌的抑制作用。(3)通过抑菌实验验证重组酵母菌株表达的抗菌肽PR39对粪链球菌和大肠杆菌均具有抑菌活性。(4)通过定向诱变筛选出非甲醇诱导重组酵母菌D-PR39-Y菌株,表达水平为55.4mg/L。结论:(1)荧光蛋白作为分子信标可以直观快速的做高表达菌株的筛选。因为DsRed2可以通过肉眼观察而GFP需要借助仪器,故相对于GFP而言DsRed2更为便捷。(2)本实验所构建的重组PR39毕赤酵母工程菌G-PR39菌株表达水平为21.8mg/L,D-PR39菌株表达水平为32.7mg/L。经诱变筛选得到的D-PR39-Y菌株表达量为55.4 mg/L,相对于D-PR39提高了69.4%。G-PR39菌株和D-PR39菌株表达产物存在差异可能原因是不同的基因融合同种基因所表现的基因毒性在一定程度上存在差异。(3)表达产物经抑菌实验证明其对大肠杆菌和粪链球菌有抑菌活性,且对大肠杆菌的抑制作用高于对粪链球菌的抑制作用。(4)利用2A肽和Biobrik设计,省去了在体外对融合蛋白进行切割的繁琐步骤,降低了蛋白融合可能带来的不良影响,提高了筛选速率;(5)利用荧光蛋白分子作分子信标及对2A肽的应用,兼顾了定性和定量的优点,实现了由分子信标对多拷贝的快速筛选。本实验为进一步筛选获得更高表达量的菌株,打下坚实的基础。