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研究背景:胰腺癌是一种具有高增殖能力和高侵袭转移能力的肿瘤,常被称为“癌中之王”。胰腺癌难以治疗,仅有不到20%的患者可通过根治性切除术治疗。根治性切除术是胰腺癌最基本的治疗方式,但研究显示其并不能提高患者的中位生存时间。因此,探寻胰腺癌高增殖性和高侵袭转移能力的原因和分子生物学机制,能为该病靶向药物的寻找和筛选提供技术指导,有望提高患者生存率。肿瘤细胞与正常细胞之间不同的基因表达模式可能是造成肿瘤细胞具有较高恶性表型的原因之一。促癌基因或抑癌基因表达的不同会产生促癌或者抑癌效应,对肿瘤细胞的功能产生影响。胰腺癌的高增殖性、高侵袭转移能力可能与癌细胞中部分促癌基因高表达和抑癌基因低表达有关。胰腺癌中特征性促癌或抑癌基因的发现和验证对阐明该病发生发展的分子机制有重要意义。CPNE是一种在草履虫中发现的Ca2+依赖的细胞膜结合蛋白,CPNE家族蛋白与肿瘤的发生和发展过程关系密切,包括CPNE1、CPNE3、CPNE7等。而CPNE8与肿瘤的相关研究较少,CPNE8被证实能与Runx1结合并在急性髓系白血病中起作用。CPNE8也是mi R-375的潜在靶基因,可能影响乳腺癌的发展。同时,CPNE8是卵巢透明细胞癌的特征基因,干扰该基因的表达能明显抑制癌细胞的增殖能力,是该病潜在的诊断和治疗靶点。这些资料提示CPNE8在肿瘤中可能起重要作用,然而其与胰腺癌的相关研究尚无。研究目的:探讨CPNE8在胰腺癌中的表达情况及其对胰腺癌细胞增殖、侵袭转移、凋亡、细胞周期等的作用。方法:1.鉴定胰腺癌的特征基因1.1高通量基因芯片检测10例胰腺癌组织和4例正常胰腺组织的基因表达情况,分析差异基因。1.2分析GSE15471数据集中胰腺癌和正常胰腺组织间的差异基因。1.3联合分析基因芯片数据和GSE15471数据集的基因表达情况和差异基因。1.4分析CPNE8表达对胰腺癌患者生存预后的影响。2.临床相关性分析和体外细胞功能实验2.1分析本研究中的基因芯片结果、GSE15471、GSE19650、GSE16515、GSE28735、TCGA和GTEx数据库中CPNE8在胰腺癌组织和正常胰腺组织的表达情况。2.2免疫组化分析CPNE8在胰腺癌及正常组织的情况。2.3免疫荧光分析CPNE8蛋白在胰腺癌细胞中的定位。2.4将胰腺癌患者分为CPNE8高/低两组（n=88,n=88）,分析两组患者性别、生存状态和年龄分布等的差异。2.5 Western blot检测CPNE8在胰腺癌和正常胰腺细胞系的表达情况。2.6干扰CFPAC-1、As PC-1中的CPNE8的表达,CCK8和克隆形成实验评估细胞增殖活力变化,transwell、划痕实验评估细胞迁移或侵袭功能变化。2.7干扰CFPAC-1中CPNE8的表达,流式细胞术检测细胞凋亡比例变化和细胞周期变化。3.体内实验和机制的初步探讨3.1 Western blot检测干扰CFPAC-1中CPNE8的表达后Bmi1和Vimentin表达变化。3.2体内实验检测敲低CPNE8表达后胰腺癌细胞裸鼠皮下成瘤能力的变化,免疫组化检测ki67和PCNA。3.3将胰腺癌患者分为CPNE8高表达和低表达组,将差异基因进行GO和KEGG通路富集分析。3.4 GSEA分析CPNE8高表达和低表达对通路富集的影响。3.5 Western blot检测干扰CPNE8表达后MAPK和p-MAPK表达变化。3.6分析CPNE8表达与Hippo通路关键分子表达的相关性。3.7构建CPNE8蛋白互作网络。结果1.鉴定胰腺癌的特征基因1.1高通量基因芯片结果显示胰腺癌组织中部分基因明显高表达,包括CEACAM6、TCN1、GPRC5A、SLPI等;部分基因明显低表达,包括SERPINI2、ALB、CEL、ERP27等。1.2分析GSE15471数据集,发现SLC6A14、GJB2、COL11A1、MATN3等在胰腺癌组织中明显高表达,而DPP10、GUCA1C、PM20D1、GNMT等在胰腺癌组织中明显低表达。1.3将基因芯片数据与GSE15471数据集进行联合分析发现:共有267个基因为共同差异基因（差异倍数>1.2,P<0.01）,如CXCR4、KLF5、S100A4、S100A6、CPNE8等。1.4 CPNE8对胰腺癌患者生存时间有显著的影响（P=0.033）。2.临床相关性分析和体外细胞功能实验2.1本研究中的基因芯片结果、GSE15471、GSE19650、GSE16515、GSE28735、TCGA和GTEx数据库的数据均显示CPNE8在胰腺癌组织中的表达显著高于正常胰腺组织。2.2免疫组化证实CPNE8的蛋白水平在胰腺癌组织中高表达,在癌旁正常胰腺组织中低表达。2.3免疫荧光发现CPNE8存在于胰腺癌细胞的胞质。2.4 CPNE8的表达量与胰腺癌患者年龄分布明显相关（P=0.032）,且与疾病分级有显著关系（P=0.035）。2.5 Western blot检测发现CPNE8在胰腺癌细胞系高表达,而在正常胰腺细胞系低表达。2.6敲低CFPAC-1和AsPC-1细胞中CPNE8表达后细胞增殖活力降低（P<0.05）,且细胞迁移和侵袭能力减弱（P<0.05）。2.7敲低CFPAC-1细胞中CPNE8表达后凋亡细胞比例增加（P<0.05）,G0/G1期细胞比例增多（P<0.05）。3.体内实验和机制的初步探讨3.1 Western blot显示干扰CPNE8表达后干性分子Bmi1和上皮间质转化相关分子Vimentin表达均下调。3.2敲低CPNE8后AsPC-1裸鼠皮下成瘤功能减弱（P<0.05）,ki67和PCNA下调。3.3分析胰腺癌患者转录组数据发现CPNE8的表达变化会影响Hippo、mTOR和Erb B等信号通路活性。3.4 GSEA富集分析发现Hippo（NES=2.02,FDR=0.000）、MAPK/ERK（NES=1.82,FDR=0.001;NES=1.63,FDR=0.011）、WNT（NES=1.51,FDR=0.021）等信号通路显著富集于CPNE8高表达患者。3.5 Western blot显示干扰CPNE8表达后MAPK和p-MAPK表达下降。3.6相关性分析显示CPNE8表达与Hippo通路关键分子YAP1（R=0.82,P=0）、STK3（R=0.8,P=0）、STK4（R=0.73,P=0）和SGMS1（R=0.7,P=0）等的表达有明显的正相关性。3.7蛋白互作网络显示CPNE8可能与CPNE蛋白家族其他成员构成蛋白互作网络,共同影响胰腺癌的发生发展。结论:CPNE8在胰腺癌中高表达,且对其增殖、侵袭转移、凋亡和细胞周期等有明显影响,是一个重要的促癌基因。