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背景与目的:cccDNA是肝细胞内pgRNA/mRNA的转录模板及HBV感染慢性化的重要标志物,在宿主细胞内的转录活性与染色体结构密切相关。表观遗传学修饰直接参与染色体结构的形成和转录调控。有研究表明组蛋白乙酰化修饰与HBV复制相关。本课题对乙酰化酶基因调控HBV cccDNA的转录和HBV复制的作用进行研究,探索影响HBV复制的关键基因,对寻找新的慢性乙型肝炎抗病毒治疗药物靶点具有重要意义。方法:1.构建人类乙酰化酶基因慢病毒RNAi文库,针对每个基因选择8对保证干扰效率的shRNA序列(A-H),构建慢病毒载体。2.A-D、E-H质粒混合,分别包装,因此每个基因含有2个病毒混合液,每个混合病毒包含4对shRNA序列。shRNA慢病毒混合液感染HepG2.2.15细胞,感染后72h,收取RNA样品,qPCR检测HBV pgRNA。收集感染Hep G2.2.15细胞96小时后的上清液,ELISA检测细胞上清HBsAg的水平。根据qPCR和ELISA/MTS结果确定影响HBV复制的乙酰化酶基因。3.将确定的阳性基因shRNA片段单独包装慢病毒,ELISA/MTS筛选能抑制HepG2.2.15细胞HBV分泌的shRNA片段。4.沉默阳性基因后,qPCR检测pgRNA的表达水平;基因沉默72小时和96小时后,CMIA检测Hep G2.2.15细胞上清分泌的HBsAg、HBeAg含量,qPCR检测HBV DNA的含量。结果:1.筛选到16个乙酰化酶基因,构建128个慢病毒载体RNAi文库。基因沉默后综合qPCR及ELISA/MTS结果得到8个潜在阳性基因及有效shRNA混合序列:CREBBP、EP300、EPC1、HAT1、KAT5、ESCO1、CSRP2BP、KAT8。2.8个基因单独包装后的36个慢病毒载体分别感染细胞,综合qPCR和ELISA/MTS结果发现HAT1、CSRP2BP和KAT8有2个以上的shRNA有效片段,这些片段的抑制效果均有统计学意义。对存在有效shRNA片段的基因的干扰效率用荧光定量PCR鉴定,除EPC1,其他基因5个shRNA序列均能沉默目的基因。3.沉默HAT1、CSRP2BP和KAT8三个基因后qPCR检测pgRNA表达明显下降,HBs Ag、HBe Ag和HBVDN A表达随时间增加而下调,KAT8无论对HBs Ag和HBe Ag的抑制都非常明显。结论:对16个乙酰化酶基因筛选和阳性基因有效shRNA片段的功能和干扰效率分析,确认三个阳性基因,每个基因至少2个shRNA片段能有效抑制目的基因表达和抑制HBs Ag的含量。沉默阳性基因,HBs Ag、HBeAg及HBV DNA抑制明显,提示HAT1、CSRP2BP和KAT8可能是影响HBV复制的乙酰化酶基因。