【摘 要】
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该文利用5,SHS的C丰富链(py)筛选Hela细胞cDNA表达文库发现三个cDNA克隆,均编码NM23-H1——一个在乳房癌和黑素瘤中具抑制肿瘤转移潜能的蛋白.为研究NM23抑制转录及抑制肿瘤
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该文利用5,SHS的C丰富链(py)筛选Hela细胞cDNA表达文库发现三个cDNA克隆,均编码NM23-H1——一个在乳房癌和黑素瘤中具抑制肿瘤转移潜能的蛋白.为研究NM23抑制转录及抑制肿瘤转移的可能作用机制,进行了下列实验:1.重组人NM23蛋白的表达、纯化用含有nm23-H1或nm23-H2基因的pET3C质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组人NM23-H1和NM23-H2蛋白,经硫酸铰分级分离、纯化柱(DEAE-Sephacel,HTP)纯化,得到纯度高于95﹪的蛋白.2.重组人NM23蛋白对5SHS、NHE成分的切割及其转录抑制活性分析用EMSA方法分析了重组人NM23-H1和NM23-H2对5SHS、NHE的DMA结合及切割活性,测定了切割位点,分析了切割模式.3.含人nm23基因的重组腺病毒的构建与扩增纯化应用PCR和DNA重组技术,将nm23 cDNA克隆到pCRⅡ 扩增载体中并测序,再将目的片段亚克隆到真核表达载体pCI中,用BglⅢ、ClaI将目的片段(包括CMV强启动子、内含子、nm23基因、IRES、hgfp基因、SV40 polyA)切下,连接入腺病毒穿棱载体pAdLink中,然后用NheI线性化nm23/pAdLink质粒,将其与ClaI线性化的野生型腺病毒dl327共转染293细胞,通过在荧光显微镜下观察发出绿色荧光的情况及Southern blot方法鉴定、筛选出发生了正确重组的含有nm23基因的重组腺病毒.大规模扩增重组腺病毒并用Vira-prep纯化柱纯化.所制得的重组腺病毒为进一步在体内外研究nm23过表达的效应打下了坚实的基础.
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