神经干细胞(Neural stem cells NSCs)是一类来源于中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)的干细胞,具有自我更新能力和多向分化潜能,能够在胚胎发育中和成年脑中分化生成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。哺乳动物CNS发育早期,脑室区的NSCs首先进行对称分裂,以增加自身数量。随后,NSCs通过不对称分裂的方式分化生成神经元,可以直接生成神经元,也可以通过生成中间前体细胞间接生成神经元,新生成的神经元会迁移到特定的位置,发育成熟具备特定的形态和功能。神经元分化结束后,NSCs还可以分化形成星形胶质细胞和少突胶质细胞,胶质细胞与神经元一起组成复杂的脑结构。NSCs的增殖与分化、成熟与迁移及由此引起的组织生长、分层等过程是CNS发育的细胞学基础。因此,NSCs自我更新和分化命运决定的调控机制的研究,成为NSCs领域中重要的基础科学问题。褪黑素是一种主要由松果体合成分泌的吲哚类激素,在许多外周组织中也有合成,例如皮肤、视网膜、胃肠道等。褪黑素的合成受光周期的调控,视网膜光感细胞接受外周光信号后,首先通过视网膜下丘脑纤维传入,传给视交叉上核,之后通过颈上神经节后交感神经纤维传出,支配松果体分泌褪黑素,呈现为白天分泌减少,黑夜分泌增加的昼夜节律性变化。褪黑素在生物体内具有广泛且重要的生理作用,包括调节生物节律,改善睡眠,抗氧化、调节免疫,抑制肿瘤等等。最重要的是,褪黑素由脑组织分泌,且易于穿越血脑屏障,因此褪黑素在脑内含量非常丰富,褪黑素对中枢神经系统有显著的保护作用。褪黑素对中风、阿尔兹海默病、帕金森病、癫痫等引起的脑部的病理改变均有保护作用。越来越多的文献表明,褪黑素的神经保护作用,从细胞层面上讲,可能与其对NSCs的调控有关,特别是褪黑素对NSCs分化命运的调控。神经干细胞的分化受到由细胞内、外环境在时间和空间上的高度精确的调控。其内部机制主要是对某些决定性因子的转录水平的调控,其转录水平在特定分化阶段被激活或者被抑制。BHLH家族是对神经干细胞的分化起到决定性作用的一类转录因子。不同的bHLH因子表达具有时空特异性,并且相互影响,互相调节,共同组成了 NSCs发育的调控网络。BHLH转录因子分为两种:一种是抑制型,例如 Hes;另一种是活化型,包括 Neurogenin(Ngn)、Mash1、NeuroD1。当抑制型bHLH转录因子处于支配地位时,NSCs将维持增殖的状态。当活化型的bHLH转录因子处于支配地位时,可促进NSCs向神经元方向分化。其中Ngn1和NeuroD1对神经元的分化起到了决定性的作用。作用机制是与E蛋白形成异二聚体,与靶基因DNA序列上的E-box序列(CANNTG)结合,同时募集大量的转录激活因子,形成一个巨大的转录激活复合体,从而激活靶基因转录。Ngn1作用于神经元方向分化的最起始阶段,激活大量靶基因,大部分是神经元分化过程中所特有的基因,其中NeuroD1是它最重要的一个靶基因,二者形成调控网络,使NSCs顺利完成向神经元分化的复杂而精细的过程。但是褪黑素对神经干细胞的分化命运的调控是否与Ngn1和NeuroD1的转录水平变化有关,还未见相关报道,有待深入研究。BHLH因子介导的神经干细胞分化受到多重调节,其中表观遗传学调节是一个重要的调节方式,越来越受到重视。表观遗传学调节是不改变DNA序列的可遗传的基因表达调控方式。主要包括DNA甲基化、组蛋白转录后修饰、非编码RNA等形式。真核细胞遗传物质染色质的基本组成单位是核小体,组蛋白H3和H4是核小体的组成成分,组蛋白H3和H4,其氨基末端尾巴可以从核小体突出出来,受到一系列转录后修饰,调节着核小体的结构,如乙酰化,甲基化,磷酸化,泛素化,糖基化,生物素化,羰基化和二磷酸腺苷的核糖基化等。组蛋白H3、H4的乙酰化修饰是最常见的一种组蛋白共价修饰方式,与基因的转录激活关系密切。组蛋白乙酰化修饰水平是由组蛋白乙酰基转移酶(Histone acetyltransferases,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(Histonedeacetylases,HDACs)分别催化组蛋白的乙酰化和去乙酰化状态决定的。HATs能够将乙酰辅酶A上的疏水乙酰基转移到组蛋白的氨基酸残基上,这样可以中和掉1个正电荷,DNA与组蛋白之间的静电吸引力减小,空间位阻增大,DNA易于解聚、舒展,有利于转录因子与DNA模板相结合,激活转录。相反,组蛋白发生去乙酰化会导致染色质呈致密、卷曲的结构,抑制转录。组蛋白乙酰化参与NSCs分化命运决定已经逐渐成为研究者的共识,在大鼠海马神经前体细胞的分化过程中,HDACs抑制剂VPA可以促进神经前体细胞向神经元方向分化。VPA处理后,神经前体细胞分化成为神经元的细胞比例显著提高。当细胞处于有利于向胶质细胞分化的培养环境时,VPA处理抑制向胶质细胞的分化,同时促进向神经元方向的分化。进一步结果证明VPA处理增高了 NeuroD1以及神经元标记物的基因转录水平。并且在体实验也证明,VPA处理之后,海马齿状回新生的神经元数目显著增加。另一篇报道以小鼠胚胎NSCs为研究对象,发现另外一种HDACs的抑制剂TSA处理后,促进NSCs向神经元方向分化,抑制NSCs向星形胶质细胞方向分化。而且,TSA处理后,分化的神经元树突长度增加,面积增大,分支增多。但是褪黑素调控NSCs的过程中是否也有组蛋白乙酰化的参与,并未见相关报道,还需深入探究。我们利用小鼠胚胎NSCs为研究对象,深入探究了褪黑素对NSCs分化命运的影响,及其对决定性因子bHLH因子转录水平的调控作用。并从表观遗传学机制角度入手,证明了褪黑素通过受体MT1激活ERK1/2信号通路,提高了CBP/p300的HAT活性,增加了 Ngn1和NeuroD1启动子区组蛋白H3第14位赖氨酸乙酰化水平,增强了两者的转录,从而促进了神经元分化。我们的研究更加印证了表观遗传学调控在NSCs细胞命运决定中的重要作用,并将褪黑素和表观遗传学调控联系起来。我们的研究首次揭示了褪黑素通过改变启动子区域染色质结构,促进NSCs分化命运决定因子Ngn1和NeuroD1的转录,构建了外源信号与内部转录因子协同调控NSCs分化命运的调控网络。我们的研究首次发现了褪黑素可以通过ERK1/2信号通路提升表观遗传学因子CBP/p300的HAT活性,有助于加深对褪黑素在NSCs命运决定中作用及在中枢神经系统发育中作用的理解,推进其临床应用的进程。第一部分褪黑素对神经干细胞分化命运的影响为了探讨褪黑素对NSCs分化命运的调控作用,于NSCs分化的多个阶段,分别检测了 NSCs的多能性、细胞周期、及终末分化比例等变化情况。结果显示,于分化培养基中培养3,5,7天的NSCs,与对照组相比,褪黑素处理组中多能性标记基因nestin阳性细胞数目显著降低,这说明具有多种分化潜能的NSCs数目降低,褪黑素可能促进了 NSCs的分化进程。NSCs的分化过程,伴随着细胞周期的退出,PHH3可以特异性标记处于M期的细胞,褪黑素处理后的NSCs中PHH3阳性率显著下降,说明更多的细胞退出细胞周期。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子P21,P27的m RNA水平显著上升,也说明了这一点。终末分化的神经元的标记基因Tuj1和星形胶质细胞的标记基因GFAP,可以进一步确定褪黑素对NSCs分化的影响。结果显示褪黑素处理后,神经元数目显著增加。而星形胶质细胞数目没有显著变化。因此说明,在分化较早期,褪黑素可以显著促进NSCs向神经元分化,并不影响NSCs向星形胶质细胞分化。为详细分析褪黑素调控NSCs分化的分子机制,我们检测了分化命运决定性因子的转录水平的变化,主要是bHLH因子中的Ngn1、NeuroD1、Hes1和Hes5。结果表明,Ngn1和NeuroD1的表达显著升高。说明褪黑素影响了两者的表达,而这很有可能是褪黑素促进NSCs分化的根本原因。Hes1,Hes5是NSCs干性状态下高表达的两种抑制性bHLH因子,两者表达降低体现了 NSCs分化程度的增加。哺乳动物神经系统中主要有两种褪黑素受体MT1,MT2。在分化过程中,MT1和MT2的表达没有显著性变化。Luzindole是MT1和MT2的抑制剂,4P-PDOT是MT2的特异性抑制剂。我们利用这两种抑制剂发现,同时抑制掉MT1和MT2,褪黑素丧失了对NSCs分化的调控作用,而特异性抑制掉MT2,褪黑素还仍然可以促进NSCs向神经元分化。因此褪黑素通过受体MT1调控NSCs分化。本实验结果显示,褪黑素可以通过受体MT1影响神经干细胞的分化命运决定过程,褪黑素处理后,更多的NSCs选择向神经元方向分化,具体表现为,细胞多能性下降,退出细胞周期,Tuj1以及MAP2等神经元的标记基因表达增加。但是不影响NSCs的胶质细胞分化进程。褪黑素通过对bHLH因子转录水平的调控,实现上述生物学效应。褪黑素可以促进Ngn1和NeuroD1的转录,抑制Hes1和Hes5的转录。本研究首次揭示了褪黑素对胚胎NSCs分化命决定因子bHLH因子的调控作用,证明褪黑素可以通过促进Ngn1和NeuroD1的转录水平,从而影响NSCs分化命运决定。第二部分褪黑素调控神经干细胞的表观遗传学机制随着干细胞研究的开展,越来越多的证据表明,新的表观遗传机制参与到调控干细胞分化命运转变过程中。组蛋白乙酰化修饰是表观遗传学调节中研究最早最透彻的转录后修饰,与基因活化关系密切。研究表明,组蛋白乙酰化修饰在神经发育过程中发挥着重要的作用,参与了 NSCs的增殖、分化命运决定等多个过程,参与调控神经发生的过程。而且有文献报道,褪黑素可能会促进小鼠海马脑区组蛋白H3、H4乙酰化水平增加。我们首先检测了与基因转录激活最相关的几个组蛋白乙酰化位点的变化。组蛋白H3第9位赖氨酸(H3K9)、组蛋白H3第14位赖氨酸(H3K14)、组蛋白H4第8位赖氨酸(H4K8)、组蛋白H4第16位赖氨酸(H4K16)。我们发现褪黑素处理后,只有H3K14乙酰化的水平显著上升,Western Blot和免疫荧光的结果都证实这一点。其他位点并没有显著变化。然后我们利用ChIP实验,特异性检测了 Ngn1和NeuroD1启动子区域,结果发现褪黑素处理后,这两者启动子区域H3K14乙酰化水平显著上升。这说明褪黑素改变了 Ngn1和NeuroD1启动子区域染色质结构,促进两者转录激活。组蛋白修饰离不开修饰酶的调控,组蛋白乙酰化修饰是由HATs和HDACs共同调控的。CBP/p300是一类HATs,两者在氨基酸序列和功能上非常相似,除了参与组蛋白乙酰化外,还可以募集转录激活因子到特定基因上,调控基因表达。这两者在神经系统发育中也发挥重要作用。CBP/p300虽然可以催化多个赖氨酸位点的乙酰化修饰,但是对组蛋白H3K14这个位点的特异性最高。首先我们利用Western Blot技术检测其两者的蛋白表达变化情况,发现褪黑素处理后并没有显著性变化。然后,我们利用HAT活性检测试剂盒检测CBP/p300的HAT活性,发现褪黑素处理后两者的HAT活性显著性上升。为进一步证明上述结论,我们利用C646抑制掉CBP/p300HAT活性。C646处理之后,H3K14的乙酰化水平显著下降,值得注意的是,Ngn1和NeuroD1的转录激活现象也消失了,同时下游的MAP2和Tuj1的表达上调的现象也消失了。这说明褪黑素确实是通过CBP/p300的HAT活性来调控组蛋白修饰的,从而进一步影响NSCs分化命运。前面我们已经证明褪黑素通过MT1调控NSCs分化,而MT1激活胞内多条信号通路,其中ERK1/2和AKT是两条比较研究透彻的与细胞分化有关的,因此我们首先对这两条通路进行了筛选。分别加入这两个通路的抑制剂,PD98059是可以抑制ERK1/2通路,LY294002可以抑制AKT通路。结果发现抑制ERK1/2通路后,可以有效抑制褪黑素促进神经元分化的效果,而抑制AKT通路没有显著变化。有文献报道,ERK1/2可以促进CBP/p300的HAT活性,因此又进一步检测了 CBP/p300 HAT活性变化,发现抑制ERK1/2通路后,褪黑素处理不能引起两者HAT活性上升。同样WB结果也证明H3K14乙酰化水平不能被褪黑素所调节。这说明褪黑素通过ERK1/2通路,激活了 CBP/p300的HAT活性活性,进而产生后续的生物学效应。我们的研究首次证明了在NSCs分化过程中,褪黑素可以特异性提高组蛋白H3K14乙酰化水平,更加印证了表观遗传学调控在NSCs细胞命运决定中的重要作用。我们的研究首次揭示了褪黑素通过改变启动子区域染色质结构,促进NSCs分化命运决定因子Ngn1和NeuroD1的转录,构建了外源信号与内部转录因子协同调控NSCs分化命运的调控网络。有助于加深对褪黑素在NSCs命运决定中作用及在中枢神经系统发育中的作用的理解,推进其临床应用的进程。