基于EGFR、STAT3信号通路探讨苇茎汤及其拆方诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的作用机制

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目的:通过体外实验研究苇茎汤及其拆方对人肺腺癌A549细胞活性、凋亡及其相关信号通路EGFR、STAT3的影响,为苇茎汤的临床应用提供理论依据。方法:采用MTT法检测不同剂量(低剂量、中剂量、高剂量)苇茎汤全方及其拆方清肺化痰方(苇茎)、渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)和活血化瘀方(桃仁)对人肺腺癌A549细胞生长的抑制作用;以倒置显微镜观察苇茎汤及其拆方对肺癌细胞的形态学影响;以荧光显微镜结合AO∕EB和DAPI荧光染色观察苇茎汤及其拆方对肺癌细胞凋亡的形态学影响;利用流式细胞术检测细胞周期,测定细胞凋亡率;应用Western blot和实时荧光定量RT-PCR技术分别从蛋白和基因两个层面检测苇茎汤及其拆方对A549细胞中凋亡信号通路EGFR、STAT3的影响。结果:1MTT法检测结果显示,与阴性对照组相比,不同剂量苇茎汤及其拆方作用24h、48h、72h后,A549细胞OD值均出现不同程度的下降,且细胞抑制率具有时间-剂量依赖性;相同剂量(中剂量)苇茎汤及其拆方作用A549细胞24h、48h、72h后,各拆方对细胞的抑制作用以清肺化痰方(苇茎)最为明显,其次是活血化瘀方(桃仁),渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱,苇茎汤全方优于各拆方。2倒置显微镜观察发现,中剂量(2.5g·L-1)苇茎汤及其拆方作用48h后,均能使A549细胞发生不同程度的形态学改变,各拆方对细胞的作用以清肺化痰方(苇茎)最为明显,其次是活血化瘀方(桃仁),渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱,苇茎汤全方优于各拆方。3AO∕EB荧光染色结果显示,与阴性对照组相比,中剂量(2.5g·L-1)苇茎汤及其拆方作用48h后,A549细胞的数量减少,亮度增强,甚至出现大量橘红色、固缩状的凋亡细胞;对A549细胞凋亡形态的影响以清肺化痰方(苇茎)最为明显,其次是活血化瘀方(桃仁),渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱,苇茎汤全方优于各拆。4DAPI荧光染色观察发现,与阴性对照组相比,中剂量(2.5g·L-1)苇茎汤及其拆方作用48h后,A549细胞的亮度增强,细胞核形态发生改变,染色质出现聚集、边缘化;对A549细胞凋亡形态的影响以清肺化痰方(苇茎)最为明显,其次是活血化瘀方(桃仁),渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱,苇茎汤全方优于各拆方。5流式细胞术检测细胞周期结果显示,与阴性对照组相比,中剂量(2.5g·L-1)苇茎汤及其拆方作用48h后,G0∕G1期A549细胞数量显著增加(P<0.01),S期和G2∕M期的细胞数量减少。6流式细胞术测定细胞凋亡结果显示,与阴性对照组相比,中剂量(2.5g·L-1)苇茎汤及其拆方作用48h后,除渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)外,其余各组A549细胞的早期凋亡率均高于阴性对照组(P<0.05)。7Western Blot结果显示,中剂量(2.5g·L-1)苇茎汤及其拆方作用48h后,A549细胞中凋亡相关蛋白EGFR、STAT3的表达水平均出现不同程度的下降,其中以清肺化痰方(苇茎)最为明显,其次是活血化瘀方(桃仁),渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱,苇茎汤全方优于各拆方。8实时荧光定量RT-PCR结果显示,中剂量(2.5g·L-1)苇茎汤及其拆方作用48h后,A549细胞中凋亡相关基因EGFR,STAT3的表达出现不同程度的下调,其中以清肺化痰方(苇茎)最为明显,其次是活血化瘀方(桃仁),渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱,苇茎汤全方优于各拆方。结论1苇茎汤及其拆方均能抑制A549细胞的生长,使其发生不同程度的形态学改变,其抑制率具有时间-剂量依赖性;各拆方对A549细胞的抑制作用以清肺化痰方(苇茎)最为明显,其次是活血化瘀方(桃仁),渗湿化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱,苇茎汤全方优于各拆方。2苇茎汤及其拆方可能通过影响EGFR,STAT3信号通路诱导A549细胞凋亡,使其发生不同程度的凋亡形态学改变,并将其阻滞于G0∕G1期;细胞凋亡、细胞周期、EGFR和STAT3信号通路均是苇茎汤及其拆方抑制肺癌细胞生长的重要靶点。3苇茎汤方中诸药,以苇茎的抗肺癌作用最强;苇茎汤可能以清肺化痰为主,兼有渗湿化痰、活血化瘀之功效,“三化”(清肺化痰、渗湿化痰、活血化瘀)并举,可使抗癌疗效增强。
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