背景及目的:卒中后抑郁(Post stroke depression,PSD)是脑卒中患者最常见的神经精神性并发症,卒中后5年内PSD累积发生率为39-52%。PSD的发病机制尚未完全明确,与神经递质、神经解剖、神经营养、炎症反应等众多机制参与相关,近年来,谷氨酸(Glu)能神经系统在抑郁症及PSD中的作用日益突出。目前临床上缺乏针对PSD的治疗药物,主要是与单胺类神经递质相关的抗抑郁药,但是这些药都有一定的副作用,寻找一种临床安全有效的治疗PSD的方法非常必要。卒中后抑郁在中医学属于“中风”、“郁证”合病范畴。正虚为PSD的病理基础,气郁、痰浊、血瘀为主要病理变化。解毒通络颗粒(专利号:201510419571.3)由人参、银杏叶、贯叶金丝桃、川芎、天麻、黄芩和栀子七味中药配伍而成,具有益气活血、解毒通络、疏肝解郁之功效,是治疗卒中后抑郁气虚血瘀证的有效复方。本研究在前期研究的基础上,结合动物模型与临床样本,从系统生物学与分子机制两方面,从Glu兴奋性毒性角度对解毒通络颗粒的神经保护机制进行探究,以期为解毒通络颗粒治疗PSD气虚血瘀证提供进一步的证据支持。方法:(1)动物模型:采用多发脑梗复合睡眠剥夺的方法制备卒中后抑郁气虚血瘀证大鼠模型。将50只大鼠随机分为对照组、模型组、氟西汀组(10mg/kg)、解毒通络低剂量组(2g/kg)、解毒通络高剂量组(4g/kg),共5组,每组10只,术后第一天开始给药,连续灌胃28天,从术后第3天开始进行睡眠剥夺。术前1天、术后14天、28天三个时间点称量体重;术后1天、14天、28天进行神经功能评分;术前、术后28天进行旷场实验、悬尾实验、糖水偏好实验;术后28天检测大鼠舌面RGB值与脉搏幅度,通过检测这些指标来观察PSD气虚血瘀证大鼠行为学与中医证候的变化。应用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)方法检测对照组、模型组、解毒通络高剂量组3组大鼠脑组织蛋白谱的变化,并进行GO功能注释和KEGG分析。采用ELISA试剂盒测定各组脑组织Glu、GABA含量。采用HE染色和电镜的方法观察大鼠海马细胞形态变化。采用免疫组化染色法与Western blot检测NMDAR2B、PSD95蛋白的表达情况。采用Western blot和qPCR检测CaMKⅣ、CREB、BDNF、TrkB的蛋白及mRNA的表达情况。(2)临床样本:选取5例临床治疗有效的患者,提取治疗前后静脉血有核细胞的总RNA,采用Real-time Quantitative PCR阵列基因芯片做miRNA检测,对获得的差异基因进行聚类分析,GO功能注释和KEGG通路分析。结果:(1)行为学结果:与对照组比较,模型组大鼠体重减少、旷场实验水平活动与直立活动减少、糖水消耗率降低、悬尾不动时间延长、神经功能缺损加重、舌面RGB值减小、脉搏幅度降低(P<0.001或P<0.05)。与模型组比较,解毒通络颗粒可增加大鼠体重、增加旷场实验水平活动与直立活动、增加糖水消耗率、缩短悬尾不动时间、改善神经功能缺损、舌面RGB值增加、脉搏幅度升高(P<0.01或P<0.05)。(2)蛋白组学检测:结果显示,对照组、模型组、解毒通络高剂量组3组共检测到3237种蛋白,其中差异倍数在1.5倍以上的蛋白共有861种。对差异蛋白从分子功能、生物学途径、蛋白类型3个方面进行GO注释,结果显示,解毒通络颗粒发挥神经保护的作用主要涉及信号转导活性、受体活性、转运活性、抗氧化活性等8类分子功能;骨架蛋白、转运体、细胞黏附分子等23类蛋白分子;细胞途径、生物发生、生物调节等一系列与信号转导及应激作用相关的途径。KEGG信号通路分析发现差异蛋白主要富集在与神经递质、神经营养因子及信号转导相关的代谢通路上,其中谷氨酸能突触、γ-氨基丁酸能突触、神经营养因子通路、MAPK信号通路、cAMP信号通路等通路可能与解毒通络颗粒对卒中后抑郁的治疗作用相关。(3)脑组织病理及超微结构观察:通过对脑组织HE染色和电镜观察可见,对照组CA3区神经元,形态正常、结构完整;电镜下细胞核呈圆形或椭圆形,核内染色质分布均匀,线粒体嵴清晰、完整。模型组HE染色见海马CA3区胞间隙增大、排列散乱,细胞数量减少,核固缩深染,出现变性坏死现象;电镜下可见核固缩、染色质边缘聚集,线粒体变形肿胀,嵴断裂,出现空泡化。解毒通络颗粒及氟西汀可以改善海马区神经元结构破坏。(4)Glu、GABA检测:与对照组比较,模型组大鼠脑组织内Glu水平显著升高(P<0.01),GABA水平均显著下降(P<0.05)。给药4周后,与模型组比较,解毒通络低、高剂量组及氟西汀组均有Glu水平显著下降(均P<0.05),GABA水平显著升高(均P<0.05)。(5)免疫组化:与对照组比较,模型组NMDAR2B阳性表达明显增加(P<0.05),PSD95阳性表达明显减少且排列疏松(P<0.05)。与模型组比较,解毒通络低、高剂量组及氟西汀组有NMDAR2B阳性表达明显减少(均P<0.05),PSD95阳性表达明显增加(均P<0.05)。(6)WB结果:与对照组比较,模型组NMDAR2B表达水平要明显增高(P<0.05),PSD95、CaMKⅣ、CREB、BDNF、TrkB表达水平要明显降低(均P<0.05);与模型组比较,解毒通络低、高剂量组及氟西汀组NMDAR2B表达水平要明显降低(均P<0.05);高剂量组及氟西汀组PSD95、CaMKⅣ、CREB、BDNF、TrkB表达水平有明显升高趋势(均P<0.05),解毒通络低剂量组PSD95、CaMKⅣ、BDNF、TrkB表达水平有明显升高趋势(均 P<0.05)。(7)qPCR结果:与对照组比较,模型组CaMKⅣ、CREB、BDNF、TrkBmRNA表达量明显减少(p<0.05或p<0.01);与模型组比较,解毒通络低、高剂量组及氟西汀组CaMKⅣ、CREB、BDNF、TrkBmRNA 表达量均有明显升高(p<0.05 或 p<0.01)。(8)miRNA表达谱芯片表达:基因芯片检测结果显示,共鉴定到18个差异倍数较高的miRNA,其中有11个下调基因,7个上调基因,上调下调基因中hsa-miR-181d-5p、hsa-miR-502-3p、hsa-miR-550a-5p是鉴定到较多的靶基因。对这些靶基因进行KEGG通路分析,发现差异基因作用靶点主要富集在谷氨酸能突触、GABA能突触、5-羟色胺突触、MAPK信号通路、cGMP-PKG信号通路等信号通路上,这些通路主要与神经可塑性、细胞黏附、细胞增殖及凋亡等功能相关。结论:(1)多发脑梗复合睡眠剥夺的方法,可以成功复制出卒中后抑郁气虚血瘀证模型,表现为体重下降、旷场活动减少、快感缺失、悬尾不动时间延长、舌面RGB值降低、脉搏幅度降低等核心症状。(2)解毒通络颗粒可改善大鼠神经行为学变化,增加体重、糖水消耗率及旷场活动能力,减少悬尾不动时间,改善舌面RGB值,增加脉搏幅度,促进神经功能恢复,对卒中后抑郁有一定的治疗效果。(3)解毒通络颗粒可通过调节脑组织内Glu与GABA水平,激活NMDAR2B下游CaMKⅣ/CREB/BDNF通路,从而抑制脑缺血后兴奋性神经毒性,发挥神经保护的作用。(4)动物蛋白质组学与临床miRNA芯片检测,从整体角度验证了解毒通络颗粒发挥神经保护机制可能与多条通路相关。