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目的:为了提高肝肿瘤治疗中5-氟尿嘧啶（5-FU）化疗药物的生物利用率,提高药物在肿瘤部位的累积以及降低药物对全身系统的毒副作用。研究构建了一种新型的靶向纳米载体,包载双药输运到肝肿瘤部位。新型靶向纳米载体具有显著提高药物利用率、延长血液循环时间、提高药物稳定性、增强肿瘤组织靶向性和滞留性。药物联合治疗增加了5-FU的生物利用率降低了全身系统毒性,提高了肝肿瘤治疗效果。本研究将两亲性三嵌段共聚物聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸-聚乙二醇（PEG-PLGA-PEG）与两种靶向分子生物素和乳糖酸（BIO和LAC）连接在一起,制备了包封姜黄素（CUR）和5-FU的BIO/LAC靶向纳米粒子（BLPPNPs/C+F）,评价双靶纳米粒子的优势,并研究联合两种药物的协同治疗肝肿瘤作用机制。实验方法:1.将聚乳酸羟基乙酸、聚乙二醇、生物素和乳糖酸通过经典酯化反应分步合成靶向纳米材料,检测材料的核磁共振氢谱。纳米沉淀法制备空载或载药双靶纳米粒子、单靶纳米粒子和无靶纳米粒子;检测三类纳米粒子的粒径、表面电位;透射电镜观察形貌特征。间接法计算载药量与包封率,研究三类纳米粒子体外释放特征和降解速率。2.MTT法检测空载或载药双靶纳米粒子、单靶纳米粒子和无靶纳米粒子在体外的细胞毒性,计算IC50值,研究双药联合对HepG2细胞的细胞毒性最佳比例。实验探究双靶纳米粒子对HepG2细胞和HL7702细胞的细胞毒性差异。流式细胞仪检测荧光强度定量分析纳米粒子的靶向性。激光共聚焦显微镜进一步观察比较体外靶向纳米粒子靶向性。3.H&E病理切片检测空载的双靶纳米粒子、单靶纳米粒子和无靶纳米粒子对小鼠主要脏器的生物相容性。紫外分光光度法检测体内纳米粒子血液循环时间。活体成像仪检测小鼠体内双靶纳米粒子的脏器分布。荷瘤裸鼠模型探究双药联合的双靶纳米粒子的治疗效果。4.蛋白质免疫印迹法探究载双药或单药的双靶纳米粒子、单靶纳米粒子和无靶纳米粒子对细胞的影响,探究联合协同抗肿瘤的机制。实验结果:1.核磁共振结果显示,成功构建了双靶聚合物（BLPP）。制备的双靶纳米粒子（BLPPNPs）具有纳米粒子特有的幽蓝色乳光,电镜观察呈现球状,BLPPNPs的粒径在187.4±2.5nm,表明成功制备双靶纳米粒子。BLPPNPs表面带适量的负电荷使纳米粒子具备良好的稳定性。BLPPNPs具有良好的缓释现象和低的降解速率。2.MTT法实验结果表明,根据USP的标准,空载双靶纳米粒子（BLPPNPs/Blank）对HepG2细胞和HL7702细胞的安全性属于l级标准,因此BLPPNPs/Blank具有良好的生物相容性。双药联合比例评价实验表明,5-FU与CUR联合投药的质量比为1:2.5的双靶纳米粒子（BLPPNPs/C+F）,协同治疗肿瘤效果较好。由于联合治疗,药物利用率有明显提高,降低的5-FU浓度则避免了全身系统毒性。而定量定性分析的靶向性实验证明,HepG2细胞对BLPPNPs表现较强的摄取,表明生物素和乳糖酸作为靶向分子促进了BLPPNPs的细胞内吞。HL7702细胞对BLPPNPs无明显增强的内吞作用。3.小鼠体内的BLPPNPs/Blank的急性毒性实验,组织切片结果显示,无明显脏器损伤和炎性反应,BLPPNPs/Blank作为药物载体,在体内同样表现出良好的生物相容性。BLPPNPs/C+F体内血液分布实验结果显示,联合两游离药物（Free/C+F）比BLPPNPs/C+F纳清除速度快,基本清除率达80%。在体内AUCt0–t值显示,BLPPNPs/C+F由于PEG的加入,具有良好的血液循环时间达24h。但是BLPPNPs/C+F的AUCt0–t值比BPPNPs/C+F、LPPNPs/C+F或PPPNPs/C+F、PLGANPs/C+F的低,说明双靶纳米粒子比其他纳米粒子更快进入组织或器官。通过双靶纳米粒子（BLPPNPs）载荧光物质脏器分布实验表明,双靶纳米粒子比单靶纳米粒子和无靶纳米粒子更多进入肿瘤组织,减少了纳米粒子进入正常组织或器官。证实了BLPPNPs具有较高的肿瘤靶向性。体内抗肿瘤活性的实验表明BLPPNPs/C+F比其他纳米粒子的肿瘤治疗效果好。4.Western blotting实验结果显示,双药协同作用机制可能是CUR通过上调p53蛋白的表达来下调DPYP蛋白的表达,增加了5-FU的细胞毒性同时增强了抗肿瘤作用。同时CUR可能降低Bcl-2蛋白的表达,增加cyt c的释放,促进肝癌细胞的凋亡。实验结论:合成了BLPP聚合物材料,制备了双靶载药纳米粒子BLPPNPs/C+F,粒径在187.4±2.5nm的规则球形,具备良好的稳定性。BLPPNPs中的5-FU和CUR具有良好的缓释性能。空双靶纳米粒子生物相容性较好。与单靶或非靶纳米粒子相比,BLPPNPs/C+F在双药投药质量比为1:2.5（5-FU:CUR）对HepG2肿瘤细胞具有更好的特异性和治疗效果。BLPPNPs/C+F比单靶和无靶纳米粒子的药物联合治疗HepG2裸鼠肿瘤更有效,同时减少了化疗药物的毒副作用,有效地抑制了肿瘤的生长。双药协同作用可能是CUR通过促进p53蛋白的表达影响5-FU的分解来增强抗癌作用,进而促进肝癌细胞的凋亡。