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病毒引起的传染病占世界传染病的四分之三以上,给人类和动物的健康带来了严重的危害,因此,抗病毒药物对于保障人类和动物的健康起着关键性的作用。然而病毒的种类众多,目前能用于临床的抗病毒药物只针对9种病毒有效（HIV、HCV、HBV、HCMV、HSV、HPV、IFV、RSV以及VZV）。尽管有大量抗病毒感染的药物研究,但药物的毒副作用、耐药性的出现以及药效不足等缺陷,亟需寻找新的策略应对病毒的感染性治疗。在病毒的防控中,疫苗是最经济有效的工具,但是由于弱毒疫苗其研制周期长,存在生物安全隐患,因此灭活疫苗和亚单位疫苗是开发新型疫苗的研究热点。然而灭活疫苗和亚单位疫苗免疫原性较差,在制苗研究中需要添加特定的佐剂来增强疫苗的免疫效果,但是市面可用的佐剂数量和种类都较少,而且这些佐剂并不适用于所有的疫苗。因此,开发新型的佐剂对于疫苗的研制至关重要。目前,纳米技术在生物医学方面显示了巨大的优势,可通过纳米技术获得新型的抗病毒药物和新型佐剂,然而寻找经济、有效、适合大规模生产可用的纳米材料是临床使用的一大挑战。碳量子点（carbon dots,C-dots）,又称碳点或者碳纳米点,是一类尺寸在10 nm以下的新型碳纳米材料。该材料制备原料广泛、操作简单、毒性小、环境友好,而且它的功能多样,生物应用研究领域广泛。近年来发现有些碳点显示出了抗病毒的作用效果,而有些碳点在体外也显示了佐剂活性的功能。因此,本研究基于碳点的生物应用为出发点,探索具有广谱抗病毒作用的新型碳点,同时研制具有良好免疫佐剂活性的功能性碳点,为预防和治疗病毒的感染提供新的材料和方法。具体研究内容与结果如下:1.苯并噁嗪衍生碳点的广谱抗病毒作用与机制研究1.1碳点的合成、表征及细胞毒性分析本研究利用水热合成法以苯并噁嗪单体为原料制备了一种苯并噁嗪单体衍生的碳点（BZM-CDs）。在电子显微镜（TEM）下观察该碳点为分散的球型,粒径为4.4±0.6 nm。该碳点在pH=7.4水溶液中的Zeta电位为0.124±0.026 eV。通过XPS与FT-IR分析BZM-CDs表面富含酰胺和羧基,在365 nm的紫外光激发下能发出绿色荧光,其荧光效率为13.1%。75μg/mL浓度下BZM-CDs分别与BHK-21和Vero细胞孵育72 h,细胞活力均大于90%。1.2 BZM-CDs体外能够抑制囊膜病毒和非囊膜病毒的感染分别以囊膜病毒中的黄病毒（JEV、ZIKV和DENV2）和非囊膜病毒（AAV和PPV）作为病毒模型,通过空斑、间免以及Western blot等方法证实,在体外将BZM-CDs与囊膜病毒中JEV、ZIKV和DENV2作用后,能够显著抑制病毒的感染,并呈剂量依赖性和时间依赖性,其EC50分别是18.63μg/mL（JEV）、3.715μg/mL（ZIKV）和37.49μg/mL（DENV2）。另外,BZM-CDs也能够抑制非囊膜病毒AAV和PPV的感染,EC50分别为40.25μg/mL（AAV）和45.51μg/mL（PPV）。1.3 BZM-CDs通过吸附病毒表面阻断病毒的入侵通过对比BZM-CDs分别处理细胞和病毒后对病毒的抑制效果,可以得出BZM-CDs的抗病毒功能主要作用于病毒,进一步用TEM观察发现BZM-CDs能够吸附在病毒表面;另外,通过细胞结合实验得出BZM-CDs与病毒作用后可抑制病毒对宿主细胞的结合,通过阻碍病毒的入侵过程从而达到抗病毒的作用。1.4 BZM-CDs表面官能团分布影响其抗病毒活性分别用氨水和盐酸加热处理BZM-CDs得到酰胺官能团更多的Ami-CDs和羧基官能团更多的Car-CDs。同样的浓度下,Ami-CDs的抗病毒能力强于BZM-CDs,而Car-CDs的抗病毒能力弱于BZM-CDs,因此,表面酰胺可以增强碳点抗病毒作用效果,而羧基会减弱其抗病毒的能力。综上所述,BZM-CDs可作为一种新型的材料在未来的抗病毒药物研究中具有一定的参考价值。2.双季铵盐衍生阳离子碳点的免疫佐剂活性作用与机制研究2.1双季铵盐衍生阳离子碳点的合成与表征本研究以双季铵盐为原料,通过水热合成法制成新型的阳离子碳点（BQAS-CDs）。该碳点通过TEM观察为分散良好的球性颗粒,粒径分布在3.74±0.63 nm。FT-IR和XPS分析发现BQAS-CDs表面富含季铵基团,365 nm的紫外光激发可发出蓝色荧光,荧光效率为7.8%。通过不同的pH值、温度、离子强度以及不同的时间暴露在紫外灯下测试BQAS-CDs的稳定性发现,pH值对其影响较大,而离子强度、温度对其影响较弱,而在紫外暴露6 h,其荧光强度值仍稳定在89.4±0.2%,因此,以上测试可以看出BQAS-CDs具有良好的稳定性。2.2 BQAS-CDs能够使蛋白发生自乳化作用以卵清蛋白（OVA）为模式蛋白,当与BQAS-CDs混合后出现自乳化现象。扫描电镜（SEM）和TEM观测蛋白呈不同程度的聚集,粒径从50 nm变为405 nm（1:1,w/w）、130.8 nm（1:2,w/w）和50.29 nm（1:3,w/w）。蛋白溶液的Zeta电位从为-5.99±0.21变化到-2.49±0.18（1:1,w/w）、-3.81±0.16（1:2,w/w）以及-4.82±0.44（1:3,w/w）。进一步测试蛋白与BQAS-CDs作用后BQAS-CDs的PL值,其发生了红移,而UV-vis分析显示蛋白在280nm处的紫外吸收峰变得更宽。因此,上述结果可以得出该碳点能够通过静电方式与OVA相互作用,导致蛋白颗粒聚集并融合成大的颗粒,从而产生肉眼可见的自乳化现象。2.3 BQAS-CDs可显著增强抗原的免疫应答BQAS-CDs与OVA形成的纳米复合物免疫小鼠后,其抗体水平比裸蛋白组高出60倍,同时能够维持较长时间的抗体水平。与商品化常规佐剂Alum相比,BQAS-CDs能够引起较高的IgG2a和IgG2b抗体的产生,分别是Alum组的3倍和5倍,具有Th1型免疫的倾向。另外,BQAS-CDs能够刺激更强的OVA特异性CD4+T和CD8+CTL细胞的增殖,因此具有细胞免疫的增强作用。2.4 BQAS-CDs可通过胞吞的方式促进抗原在APCs的吞噬用BMDCs和RAW264.7细胞孵育BQAS-CDs与OVA-FITC的复合物,通过共聚焦荧光显微镜和流式细胞术分析,BQAS-CDs能够显著促进抗原的吞噬。而低温条件孵育BQAS-CDs与OVA-FITC的复合物时,抗原的吞噬效果没有显著变化,因此可以得出BQAS-CDs主要以胞吞的方式促进抗原被APCs吞噬。进一步用流式检测BQAS-CDs处理BMDCs细胞后的CD40和CD80阳性细胞比例无明显变化,其结果证实BQAS-CDs并不会直接诱导DCs细胞的成熟。2.5 BQAS-CDs体内具有良好的生物相容性体内生物相容性分析显示BQAS-CDs免疫机体后不影响小鼠体重的增殖,而且免疫小鼠的血常规没有引起显著的血液学变化。另外,小鼠的组织内脏器官也没有明显的组织学改变。根据以上结果可以得出BQAS-CDs在体内具有良好的生物相容性,且对未来开发新型佐剂具有一定的应用潜力。