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背景microRNA (miRNA)是近年来发现的一类长度仅为18-25个核苷酸的内源性非编码小RNA,成熟miRNA的5’非翻译区的2-7个核苷酸的“种子序列”可以与靶mRNA的3’.非翻译区互补结合,在转录后水平上抑制靶基因的表达。1993年,首个microRNA lin-4被发现,从此揭开了对microRNA研究的序幕。随后,许多实验室从线虫、果蝇、家鼠、拟南芥及人类等多种真核生物中发现了至少500种这类小分子RNA,其中在人类染色体上就有300余种,占人类基因的1-4%。miRNA的编码基因是目前最大的一类调节基因。它在细胞的生长、增殖、发育和凋亡过程中发挥着重要作用,并与许多肿瘤的发生、发展相关。miRNA在肿瘤中发挥着相当于癌基因或抑癌基因的作用,调节着肿瘤细胞的多种重要生物学行为。原发性肝癌是世界范围内发病率高、恶性程度高、预后差的恶性肿瘤之一,它的发病是多因素导致的复杂过程。对于肝癌发生、复发与转移分子机制的探讨依然是目前肿瘤分子生物学研究领域最为重要的问题。与其它恶性肿瘤一样,肝癌的发生与发展是包括原癌基因激活或/和抑癌基因失活的多阶段多步骤的过程。在此过程中,基因突变、染色体扩增等基因遗传学的改变无疑发挥着极其重要的作用。除此之外,表观遗传学的改变,尤其是microRNA表达改变造成的原癌基因的失活或抑癌基因的沉默也同样发挥着重要作用。目前发现很多miRNAs在肝癌中异常表达,并在肝癌的发生发展中扮演着重要的角色。例如,miR-122是一个肝脏特异性miRNA,在肝脏发育以及肝脏正常功能的维持中发挥调节。与正常肝组织相比,肝癌组织中miR-122的表达明显下调；而肝癌细胞中的miR-221/222的表达却明显升高,miR-221/222可以通过抑制其靶基因-抑癌基因CDKN1B/p27和CDKN1C/p57而发挥作用。随着研究的不断深入,越来越多的miRNA被证明在肝癌的进展中发挥重要作用,而鉴定这些miRNA,明确其发挥作用的靶基因和分子机制,无疑对于人们早日阐明恶性肿瘤的病理机制、发掘潜在的肿瘤诊治靶标、研发新的恶性肿瘤的分子诊断和治疗方法具有重要意义。在本研究中,参考国内外相关文献报道肝癌miRNA表达谱的研究结果,结合生物信息学分析,初步确定miR-125b为我们的研究重点。目的首先明确miR-125b在肝癌组织及肝癌细胞系中的表达水平,在此基础上进一步明确miR-125b在肝癌细胞中的生物学意义,分析并验证其发挥作用的靶基因,探索其在肿瘤发生发展中可能的分子作用机制。方法1.检测miR-125b在肝癌组织及肝癌细胞系中的表达水平。收集9例肝癌患者肿瘤及周围非瘤组织手术标本,6株肝癌细胞系及一株永生化肝细胞系,经提取RNA,反转录后得到cDNA,运用实时荧光定量PCR技术检测miR-125b的表达水平。2.构建miR-125b真核表达载体,通过慢病毒包装系统获得过表达miR-125b的毒液,继而攻击肝癌细胞,并通过流式分选获得高纯度的过表达miR-125b的肝癌细胞株。3.通过MTT、克隆形成、裸鼠体内成瘤实验、流式细胞术、Hoechst33342细胞染色等检测miR-125b过表达对细胞增殖、凋亡的影响。4.通过双荧光素酶报告系统、Western blot及免疫组化技术探讨miR-125b的靶基因。结果1.分别检测了9例肝癌组织及配对的癌旁组织、6株肝癌细胞系及一株永生化肝细胞系L-02中miR-125b的表达水平,发现在大部分肝癌组织(7/9)和肝癌细胞系(5/6)中miR-125b表达水平降低。2.成功构建了miR-125b真核表达载体pHRS-1cla-miR-125b-CMV-EGFP,测序正确,继而经基因转染获得稳定过表达miR-125b的肝癌细胞株。MTT、克隆形成实验及裸鼠皮下成瘤实验证实miR-125b抑制了肝癌细胞的体内体外增殖能力；流式细胞术、Hoechst33342细胞染色证实miR-125b促进了正常培养的及化疗药物诱导的肝癌细胞的凋亡。3. Western blot发现稳定过表达miR-125b的肝癌细胞株Bcl-2蛋白的表达水平较对照组细胞明显降低；裸鼠皮下成瘤实验获得的肿瘤组织经免疫组化染色发现过表达miR-125b的肝癌细胞所致的肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达水平同样较对照组肿瘤组织明显降低。4.构建pGL3-Bcl-2-UTR荧光素酶报告基因质粒,与PHRS-1cla-miR-125b-CMV-EGFP真核表达载体共转染293FT细胞后,荧光素酶报告基因活性明显降低,表明miR-125b过表达可直接作用于Bcl-2-3’UTR的靶序列,下调靶基因Bcl-2的表达。结论本研究初步揭示了miR-125b在肝癌细胞系及肝癌组织中的表达降低,在肝癌细胞中过表达miR-125b可以促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖及其裸鼠成瘤能力,Bcl-2被证实是miR-125b调控的靶基因。以上研究结果为更加深入研究肝癌的发生、发展机制以及临床治疗奠定了基础。