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α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)属外切糖苷酶类，在自然界中分布广泛，可在体外水解糖复合物。 本课题组采用RT-PCR方法，从中国海南Catimor咖啡豆中克隆了α-半乳糖苷酶cDNA，全长1.1Kb，构建了其表达载体，电穿孔法导入毕赤酵母GS115细胞，筛选出重组α-半乳糖苷酶菌株。离子交换层析纯化出α-半乳糖苷酶，酶比活性从15U／mg提高到28.14U／mg。进一步鉴定了酶的生物化学性质，其Km=0.275mmol／L，Vmax=0.014mmol／L／min。 本研究在此基础上，尝试了基因重组α-半乳糖苷酶菌株在5 L发酵罐中的表达扩增以及从发酵液中纯化α-半乳糖苷酶的研究。并在pH=5.5-5.6、每mL红细胞使用100U的基因重组α-半乳糖苷酶、26℃、2 h条件下，成功地清除了人B型红细胞表面B抗原。 本研究着重开展了人B→O血型改造的动物实验研究，首先分别用吸收放散法和常规血型检测法筛选出合适的猕猴(rhesus monkey)和长臂猿(gibbon)，用批量制备的基因重组α-半乳糖苷酶对类人B型猕猴红细胞(rhesus monkey red blood cells，rRBC)和B型长臂猿红细胞(gibbon red blood cells，gRBC)表面抗原进行酶解，观察B抗原清除情况以及酶解对红细胞结构和功能是否有影响；经酶解后的B型红细胞再回输给类人A型猕猴和A型长臂猿，检测经α-半乳糖苷酶酶解后，供体红细胞在受体动物体内24h存活率和半衰期，观察其能否正常存活；对受血动物的输血安全性进行评价，分析回输后急性、慢性输血反应；以及检测受体动物体内有无因α-半乳糖苷酶引起的α-半乳糖苷酶抗体产生。 实验证明：用100U／ml的α-半乳糖苷酶对类人B型猕猴和B型长臂猿的红细胞进行酶解，可以有效的清除猕猴红细胞类人B抗原和长臂猿红细胞B抗原；酶解后红细胞结构和功能未发生改变；回输给类人A型猕猴和A型长臂猿后，经α-半乳糖苷酶酶解的红细胞在受体动物体内24h存活率和半衰期与酶解前一致，符合FDA输血标准；受血动物尿液和血液生化指标未发生明显改变；受血动物体内无α-半乳糖苷酶抗体产生。 总之，动物实验充分证明使用酶解反应后的通用O型血(Enzymatically摘要eonverted oroup 0 Red Blood eells，ECORBC)是安全的。动物实验的成功为今后申报B分O血型改造进入人体临床输血实验观察，奠定了重要基础。