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第一部分JOSD1通过稳定MCL1抑制线粒体凋亡通路进而促进妇科肿瘤的获得性耐药过程
妇科肿瘤是女性肿瘤中一种主要的类型，其中以子宫及卵巢肿瘤最为常见。卵巢癌病死率高居妇科肿瘤之首，而宫颈癌是女性第二常见的恶性肿瘤，妇科肿瘤的高发病率和高致死率严重危害了女性的生命健康和生活质量。而获得性耐药是导致妇科肿瘤不良预后的主要因素之一，但是其内在的分子机制尚未被完全阐释清楚。E3泛素连接酶与去泛素化酶通过翻译后修饰的机制调控许多重要癌蛋白及抑癌蛋白的表达，因而成为近年来肿瘤研究领域的热点。因此，通过揭示去泛素化修饰在妇科肿瘤获得性耐药过程中的异常调控，有望获得解决耐药问题的新思路。
本研究中我们构建体内耐药模型和耐药细胞株以模拟获得性耐药的建立，通过qPCR方法检测到JOSD1是这一过程中最显著上调的去泛素化酶，预示了其在获得性耐药中的重要作用。为进一步探索JOSD1在妇科肿瘤中的功能，首先我们在妇科肿瘤细胞系中敲降JOSD1，结果显示肿瘤细胞在正常培养条件下发生了严重的凋亡。随后的体内外功能实验也证实了JOSD1的缺失能够抑制卵巢癌和宫颈癌细胞的生长。而且，腺相关病毒介导的JOSD1-shRNA干扰能够显著抑制卵巢癌PDX的生长。机制上，质谱分析、免疫共沉淀实验和体内外去泛素化实验均证实抗凋亡蛋白MCL1是去泛素化酶JOSD1的作用底物。同时免疫荧光实验表明JOSD1和MCL1共同定位于细胞质中。我们还发现，随着卡铂处理时间的延长，JOSD1与MCL1的相互结合能力变强，提示JOSD1可能通过结合MCL1发挥其抗凋亡作用。放线菌酮(CHX)检测半衰期实验显示，过表达JOSD1能够促进MCL1的稳定性，而其酶活突变体JOSD1C36A失去该功能;当敲降JOSD1后，MCL1的半衰期显著缩短。体外实验证实，在卡铂处理的情况下，与对照组相比过表达JOSD1能够显著地促进肿瘤的生长;但是同时敲降MCL1后，这种优势消失，该结果说明JOSD1是通过稳定MCL1发挥其促妇科肿瘤细胞耐药的功能。此外，对150例卵巢癌标本中JOSD1和MCL1的表达进行分析，我们发现JOSD1与MCL1的表达水平呈高度正相关，并且JOSD1/MCL1的高表达与化疗不敏感及不良预后相关。令人激动的是，我们在胞外培养基中检测到JOSD1蛋白，提示JOSD1可能是一种分泌蛋白;并且耐药细胞株上清培养基中分泌的JOSD1水平远远高于亲本细胞株上清培养基中的水平。我们进一步对20对卵巢癌组织及配对的血清分别进行免疫组织化学染色和蛋白免疫印迹检测，发现JOSD1蛋白在血清中与细胞内的水平呈正相关，提示血清中的JOSD1水平可作为临床诊断及预后评价的一个指标。
综上，我们的研究首次揭示了JOSD1在肿瘤中的功能，其通过去泛素化稳定MCL1，进而抑制线粒体凋亡通路，从而促进妇科肿瘤细胞获得性耐药的发生;同时我们也提出JOSD1是一个潜在的基因治疗靶点以及是一个有前景的临床诊断及预后评价指标。
关键词:妇科肿瘤;获得性耐药;JOSD1;MCL1;基因治疗靶点
第二部分MGMT通过转录激活DUB3稳定MCL1从而促进卵巢癌耐药
卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，其发病率在妇科恶性肿瘤中排名第二，是致死率最高的妇科恶性肿瘤。大部分卵巢癌患者在发现时已处于晚期，肿瘤减灭手术和辅助化疗是晚期卵巢癌患者的主要治疗方案，但大多数患者在治疗过程中产生耐药，导致肿瘤的复发和转移。耐药是导致卵巢癌治疗失败的关键因素之一，严重威胁了女性的生命健康和生活质量，是临床上一个亟待解决的问题。因此，探究导致卵巢癌耐药的具体机制，寻找关键和有效的治疗靶点，筛选潜在的小分子抑制剂，进而逆转卵巢癌细胞对化疗药物的抵抗，对于改善卵巢癌患者的预后具有重要意义。
肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是一个多因素复杂的过程，而凋亡逃逸是导致肿瘤耐药的一个重要因素。MCL1是抗凋亡BCL-2家族中一个非常重要的蛋白，其在包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤中异常高表达，并导致放化疗抵抗。因此，通过揭示MCL1在卵巢癌中的过表达机制，有望发现新的治疗靶点，从而增加卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性。E3泛素连接酶与去泛素化酶通过翻译后修饰的机制调控许多重要癌蛋白和抑癌蛋白的稳定性，进而广泛参与到肿瘤的发生与进展过程之中，因而成为近年来肿瘤研究领域的热点。而MCL1的蛋白水平严格受到泛素蛋白酶体途径的调控;因此，本研究深入探讨了去泛素化酶对MCL1的稳定作用。
本课题通过筛选包含66个去泛素化酶的cDNA文库，发现DUB3是最显著上调MCL1蛋白水平的去泛素化酶。DUB3对MCL1的蛋白水平调节呈现剂量依赖的方式，但MCL1的mRNA水平并没有发生明显改变，说明DUB3是在翻译后水平对MCL1进行调控。放线菌酮CHX检测半衰期实验表明，过表达DUB3能够增加MCL1的稳定性，但是敲降DUB3后，MCL1的半衰期显著缩短。随后，我们通过免疫共沉淀实验证实DUB3与MCL1之间存在相互结合，进一步研究发现二者间的互作主要依赖于DUB3的N端以及MCL1的N端结构域。体内泛素化实验表明过表达DUB3可以显著降低MCL1的泛素化水平，但是其酶活突变体DUB3C89S失去此功能，说明DUB3对MCL1的稳定作用依赖于其去泛素化酶活性。随后，通过检测9株卵巢癌细胞系中二者的蛋白水平，我们发现DUB3与MCL1的表达水平呈显著正相关，但另外两个已知的MCL1的DUB(USP9X和USP13)与MCL1表达水平并无正相关关系。此外，CHX追踪实验和泛素化实验表明DUB3对MCL1半衰期的延长能力以及去泛素化能力均强于USP9X和USP13。截短体泛素化实验证实DUB3和USP9X主要对MCL1的N端进行去泛素修饰，而USP13主要修饰C端。接下来，通过构建MCL1的突变体，我们进一步发现DUB3主要是对MCL1的第40位赖氨酸进行去泛素化修饰。以上结果提示:在卵巢癌中，DUB3是稳定MCL1的最主要的去泛素酶。另外，体内外功能实验表明DUB3的缺失促进卵巢癌细胞凋亡并且增加了癌细胞对卡铂的敏感性，而这种作用能够被MCL1的异位表达所逆转;另一方面，稳定过表达DUB3可以显著促进卵巢癌细胞的存活及药物抵抗。
接下来，通过对小分子抑制剂库的筛选，我们发现MGMT抑制剂Patrin-2对DUB3的转录有明显的抑制作用。而且在9株卵巢癌细胞系中，MGMT的蛋白水平和DUB3的mRNA水平存在显著的正相关关系，进一步证实了MGMT在转录水平激活DUB3的表达。体内外实验揭示在MGMT/DUB3/MCL1高表达的卵巢癌细胞系中使用Patrin-2可以显著抑制肿瘤细胞的生长，而在低表达细胞系中没有此效果。有趣的是，在筛选过程中我们发现HDAC抑制剂可以显著提高DUB3的mRNA水平，并且后续通过功能实验证实HDAC抑制剂能够增加卵巢癌细胞对Patrin-2的敏感性。最后，对150例卵巢癌临床标本进行表达分析，MGMT、DUB3和MCL1的表达水平，两两之间存在显著的正相关关系，并且MGMT/DUB3/MCL1的高表达与化疗不敏感及不良预后相关。
综上，我们的研究揭示了MGMT/DUB3/MCL1调控轴在卵巢癌耐药中的重要促进作用，并且提出联合使用Patrin-2和HDAC抑制剂可以有效的克服卵巢癌的耐药问题，在临床治疗中具有潜在的应用前景。
妇科肿瘤是女性肿瘤中一种主要的类型，其中以子宫及卵巢肿瘤最为常见。卵巢癌病死率高居妇科肿瘤之首，而宫颈癌是女性第二常见的恶性肿瘤，妇科肿瘤的高发病率和高致死率严重危害了女性的生命健康和生活质量。而获得性耐药是导致妇科肿瘤不良预后的主要因素之一，但是其内在的分子机制尚未被完全阐释清楚。E3泛素连接酶与去泛素化酶通过翻译后修饰的机制调控许多重要癌蛋白及抑癌蛋白的表达，因而成为近年来肿瘤研究领域的热点。因此，通过揭示去泛素化修饰在妇科肿瘤获得性耐药过程中的异常调控，有望获得解决耐药问题的新思路。
本研究中我们构建体内耐药模型和耐药细胞株以模拟获得性耐药的建立，通过qPCR方法检测到JOSD1是这一过程中最显著上调的去泛素化酶，预示了其在获得性耐药中的重要作用。为进一步探索JOSD1在妇科肿瘤中的功能，首先我们在妇科肿瘤细胞系中敲降JOSD1，结果显示肿瘤细胞在正常培养条件下发生了严重的凋亡。随后的体内外功能实验也证实了JOSD1的缺失能够抑制卵巢癌和宫颈癌细胞的生长。而且，腺相关病毒介导的JOSD1-shRNA干扰能够显著抑制卵巢癌PDX的生长。机制上，质谱分析、免疫共沉淀实验和体内外去泛素化实验均证实抗凋亡蛋白MCL1是去泛素化酶JOSD1的作用底物。同时免疫荧光实验表明JOSD1和MCL1共同定位于细胞质中。我们还发现，随着卡铂处理时间的延长，JOSD1与MCL1的相互结合能力变强，提示JOSD1可能通过结合MCL1发挥其抗凋亡作用。放线菌酮(CHX)检测半衰期实验显示，过表达JOSD1能够促进MCL1的稳定性，而其酶活突变体JOSD1C36A失去该功能;当敲降JOSD1后，MCL1的半衰期显著缩短。体外实验证实，在卡铂处理的情况下，与对照组相比过表达JOSD1能够显著地促进肿瘤的生长;但是同时敲降MCL1后，这种优势消失，该结果说明JOSD1是通过稳定MCL1发挥其促妇科肿瘤细胞耐药的功能。此外，对150例卵巢癌标本中JOSD1和MCL1的表达进行分析，我们发现JOSD1与MCL1的表达水平呈高度正相关，并且JOSD1/MCL1的高表达与化疗不敏感及不良预后相关。令人激动的是，我们在胞外培养基中检测到JOSD1蛋白，提示JOSD1可能是一种分泌蛋白;并且耐药细胞株上清培养基中分泌的JOSD1水平远远高于亲本细胞株上清培养基中的水平。我们进一步对20对卵巢癌组织及配对的血清分别进行免疫组织化学染色和蛋白免疫印迹检测，发现JOSD1蛋白在血清中与细胞内的水平呈正相关，提示血清中的JOSD1水平可作为临床诊断及预后评价的一个指标。
综上，我们的研究首次揭示了JOSD1在肿瘤中的功能，其通过去泛素化稳定MCL1，进而抑制线粒体凋亡通路，从而促进妇科肿瘤细胞获得性耐药的发生;同时我们也提出JOSD1是一个潜在的基因治疗靶点以及是一个有前景的临床诊断及预后评价指标。
关键词:妇科肿瘤;获得性耐药;JOSD1;MCL1;基因治疗靶点
第二部分MGMT通过转录激活DUB3稳定MCL1从而促进卵巢癌耐药
卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，其发病率在妇科恶性肿瘤中排名第二，是致死率最高的妇科恶性肿瘤。大部分卵巢癌患者在发现时已处于晚期，肿瘤减灭手术和辅助化疗是晚期卵巢癌患者的主要治疗方案，但大多数患者在治疗过程中产生耐药，导致肿瘤的复发和转移。耐药是导致卵巢癌治疗失败的关键因素之一，严重威胁了女性的生命健康和生活质量，是临床上一个亟待解决的问题。因此，探究导致卵巢癌耐药的具体机制，寻找关键和有效的治疗靶点，筛选潜在的小分子抑制剂，进而逆转卵巢癌细胞对化疗药物的抵抗，对于改善卵巢癌患者的预后具有重要意义。
肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是一个多因素复杂的过程，而凋亡逃逸是导致肿瘤耐药的一个重要因素。MCL1是抗凋亡BCL-2家族中一个非常重要的蛋白，其在包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤中异常高表达，并导致放化疗抵抗。因此，通过揭示MCL1在卵巢癌中的过表达机制，有望发现新的治疗靶点，从而增加卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性。E3泛素连接酶与去泛素化酶通过翻译后修饰的机制调控许多重要癌蛋白和抑癌蛋白的稳定性，进而广泛参与到肿瘤的发生与进展过程之中，因而成为近年来肿瘤研究领域的热点。而MCL1的蛋白水平严格受到泛素蛋白酶体途径的调控;因此，本研究深入探讨了去泛素化酶对MCL1的稳定作用。
本课题通过筛选包含66个去泛素化酶的cDNA文库，发现DUB3是最显著上调MCL1蛋白水平的去泛素化酶。DUB3对MCL1的蛋白水平调节呈现剂量依赖的方式，但MCL1的mRNA水平并没有发生明显改变，说明DUB3是在翻译后水平对MCL1进行调控。放线菌酮CHX检测半衰期实验表明，过表达DUB3能够增加MCL1的稳定性，但是敲降DUB3后，MCL1的半衰期显著缩短。随后，我们通过免疫共沉淀实验证实DUB3与MCL1之间存在相互结合，进一步研究发现二者间的互作主要依赖于DUB3的N端以及MCL1的N端结构域。体内泛素化实验表明过表达DUB3可以显著降低MCL1的泛素化水平，但是其酶活突变体DUB3C89S失去此功能，说明DUB3对MCL1的稳定作用依赖于其去泛素化酶活性。随后，通过检测9株卵巢癌细胞系中二者的蛋白水平，我们发现DUB3与MCL1的表达水平呈显著正相关，但另外两个已知的MCL1的DUB(USP9X和USP13)与MCL1表达水平并无正相关关系。此外，CHX追踪实验和泛素化实验表明DUB3对MCL1半衰期的延长能力以及去泛素化能力均强于USP9X和USP13。截短体泛素化实验证实DUB3和USP9X主要对MCL1的N端进行去泛素修饰，而USP13主要修饰C端。接下来，通过构建MCL1的突变体，我们进一步发现DUB3主要是对MCL1的第40位赖氨酸进行去泛素化修饰。以上结果提示:在卵巢癌中，DUB3是稳定MCL1的最主要的去泛素酶。另外，体内外功能实验表明DUB3的缺失促进卵巢癌细胞凋亡并且增加了癌细胞对卡铂的敏感性，而这种作用能够被MCL1的异位表达所逆转;另一方面，稳定过表达DUB3可以显著促进卵巢癌细胞的存活及药物抵抗。
接下来，通过对小分子抑制剂库的筛选，我们发现MGMT抑制剂Patrin-2对DUB3的转录有明显的抑制作用。而且在9株卵巢癌细胞系中，MGMT的蛋白水平和DUB3的mRNA水平存在显著的正相关关系，进一步证实了MGMT在转录水平激活DUB3的表达。体内外实验揭示在MGMT/DUB3/MCL1高表达的卵巢癌细胞系中使用Patrin-2可以显著抑制肿瘤细胞的生长，而在低表达细胞系中没有此效果。有趣的是，在筛选过程中我们发现HDAC抑制剂可以显著提高DUB3的mRNA水平，并且后续通过功能实验证实HDAC抑制剂能够增加卵巢癌细胞对Patrin-2的敏感性。最后，对150例卵巢癌临床标本进行表达分析，MGMT、DUB3和MCL1的表达水平，两两之间存在显著的正相关关系，并且MGMT/DUB3/MCL1的高表达与化疗不敏感及不良预后相关。
综上，我们的研究揭示了MGMT/DUB3/MCL1调控轴在卵巢癌耐药中的重要促进作用，并且提出联合使用Patrin-2和HDAC抑制剂可以有效的克服卵巢癌的耐药问题，在临床治疗中具有潜在的应用前景。