论文部分内容阅读
2006年日本科学家山中申弥(Shinya Yamanaka)筛选并利用4个多能性因子Oct4、Sox2、cMyc和Klf4(OSKM),幻通过逆转录病毒侵染的方式,成功的将小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)转变为诱导多能性干细胞(iPSCs),此后几年间,世界各地科学家利用这几种多能性因子分别诱导胚胎成纤维细胞(EFs)获得了人、猴、大鼠、猪、兔、牛、犬和羊等物种的iPSCs。蝙蝠作为一种重要的抗病毒和长寿模型,近年来一直是科学家研究的热点。由于蝙蝠不同于啮齿类和家畜等可饲养动物,很难方便和安全的获得EFs甚至是成体细胞;而且相对于体细胞而言,iPSCs具有无限增殖的能力,可以替代胚胎干细胞(ESCs)进行基因打靶和生成嵌合体,以研究基因的功能,因此诱导获得的蝙蝠iPSCs将有重要的应用价值。我们建立了蝙蝠(Myotis lucifugus)胚胎成纤维细胞系(BEFs),构建了蝙蝠iPSCs的诱导载体pStem-h103,该载体是由piggyBaac (PB)介导,含有8个多能性因子(Oct4, So2,cMyc,Klf4, Nanog,Lin28,Nr5a2和miRNA302/367),诱导效率普遍高于4因子或6因子诱导载体,最高效率可达到1%。诱导获得的蝙蝠iPSCs在3i培养基中的克隆形态类似于小鼠胚胎干细胞(mESCs),紧凑光亮并呈现隆起状,边缘清晰,且连续传代45次以上不分化。在获得蝙蝠iPSCs最佳电转条件后,我们尝试用PB酶表达载体将其外源插入序列去除干净并建立细胞系。获得的蝙蝠iPSCs具有正常的核型:42+XY;碱性磷酸酶(AP)染色呈现阳性,初步证明其具有多能性;注射不同剂量的iPSCs至SCID裸鼠可以形成不同大小的畸胎瘤,对获得的畸胎瘤进行苏木精-伊红(HE)染色发现iPSCs可以在体内分化形成三个胚层不同组织类型的细胞,在体外使用不含LIF的ESC培养基可以使蝙蝠iPSCs分化形成拟胚体(EBs),证明了蝙蝠iPSCs具有体内和体外的分化能力;利用定量PCR检测蝙蝠多能性基因相对于BEFs的表达情况,发现Oct4和Sox2的表达大幅度提高,而Klf4和cMyc的表达在一定程度上降低,证明了诱导获得的蝙蝠iPSCs既具有稳定的多能性,又非细胞癌变所致;对蝙蝠iPSCs进行了免疫荧光染色,结果TBX3+,OCT4+,SOX2+, NANOG+,TRA-1-60low,Western blot实验表明蝙蝠iPSCs核心转录因子OCT4和SOX2蛋白表达水平接近mESCs。蝙蝠iPSCs可以与猪囊胚在体外发生嵌合,并能够从透明带中与囊胚一起孵化出来,这为今后获得异源嵌合体猪和实现利用蝙蝠iPSCs生成嵌合体奠定了良好的基础。以上实验证明了诱导获得的蝙蝠iPSCs具有类似于mESCs的多能性特征。iPSCs最重要的应用之一是用来进行基因打靶,我们利用传统同源重组方法对猪胚胎成纤维细胞(PEFs),猪和蝙蝠的iPSCs进行了基因打靶实验,对PEFs打靶取得了成功,但是没有获得猪和蝙蝠iPSCs打靶成功的阳性克隆,证实iPSCs比体细胞打靶更为困难,需要使用基因打靶新技术以提高成功率。本实验构建了蝙蝠Oct4基因的CRISPR-Cas9打靶载体,尝试使用Cas9系统对蝙蝠iPSCs进行基因打靶,结果表明利用Cas9系统具有获得蝙蝠iPSCs打靶成功阳性克隆的潜力。