恶性肿瘤严重危害人类生命健康,目前它已经超过心脑血管疾病而跃居为人类致死疾病的首位。全世界每年死于恶性肿瘤的人数超过700万,仅在我国每年新发肿瘤病人达200余万,死亡约160万人。对于大多数种类的肿瘤,仍在沿用传统疗法如手术、放疗、化疗等进行治疗,然而面对很多恶性肿瘤,传统疗法显得束手无策。而基因治疗方案至今在临床治疗中仍然没有实质上的突破。二十世纪九十年代,随着分子生物学、肿瘤学及病毒学本身的发展,肿瘤发生的分子机制,细胞与病毒间的作用机制,信号传导通路,凋亡抑制与诱发机制等逐渐被阐明,用病毒治疗肿瘤成为研究的热点。这种能选择性地在肿瘤细胞中复制,并进一步杀灭肿块,被称为条件性复制病毒或选择性复制病毒(conditional replicative viruses),或溶瘤病毒(oncolytic viruses)。本室构建的缺失凋亡抑制基因icp34.5并插入LacZ基因的单纯疱疹病毒(mtHSV)就是一种有靶向性的溶瘤病毒。一般说来,蛋白激酶R(PKR)介导的磷酸化反应和翻译起始因子eIF-2α的失活,导致蛋白翻译的抑制,细胞凋亡。WtHSV-1的ICP34.5C-末端可以和蛋白磷酸酶I(PP1)结合,使eIF-2α去磷酸化而成为活性蛋白,保证蛋白质合成继续,病毒复制得以完成。但在很多肿瘤细胞中,很可能是由于IFN-PKR信号传导途径的缺陷,eIF-2α不能磷酸化而成为活性态,细胞得以生存,因此,这条信号通路不能引发这些肿瘤细胞凋亡。因此,即使缺失icp34.5基因的HSV-1病毒(mtHSV)也能在IFN-PKR缺陷的肿瘤细胞中复制,并在复制后以溶瘤方式释放病毒,杀死肿瘤细胞。由于icp34.5是一个凋亡抑制基因,又对eIF-2α有激活功能,因此,icp34.5的缺失,mtHSV在感染正常细胞时,由于正常细胞的凋亡,mtHSV不能复制,所以,mtHSV对正常细胞是安全的。体外细胞水平我们已经证明mtHSV选择性的在肿瘤细胞中复制,而在正常细胞中不复制。动物水平mtHSV被证明在荷Hep3B肝癌裸鼠和荷小鼠肉瘤S-180细胞Balb/c鼠中治疗肿瘤是有效的,而且对正常组织无毒副作用。一般认为,1型单纯疱疹病毒(HSV-1)对多数人只引起反复发作的温和感染,极少威胁到人的生命。但是一个不可回避的事实是HSV-1一般传播的非常快速和广泛。HSV-1对人的潜伏感染的时间是非常长的,一般初次感染没有症状。据统计,60-90 %的人受过HSV-1不同程度的感染,许多肿瘤病人的血清在mtHSV治疗前是HSV阳性的,因而抗体和白细胞等会有效地阻止和清除HSV的再次感染。mtHSV对肿瘤治疗已经证明是有效的,但是HSV-1血清阳性个体的肿瘤治疗还未曾研究。因此,我们深入地研究了mtHSV对HSV预免疫的血清阳性Balb/c鼠的肿瘤治疗效果。Balb/c鼠用mtHSV或野生型HSV-1 F腹腔注射免疫,随后将HSV免疫后的HSV(mtHSV和wtHSV-1)血清阳性鼠和正常小鼠在左肢腋下建立小鼠肉瘤模型,然后用mtHSV瘤内注射治疗肿瘤。野生型HSV-1 F免疫鼠经mtHSV治疗后肿瘤平均生长率被极大地抑制,达到76.07 %,平均生存期也被显著延长,小鼠生存率提高62.5 %,与mtHSV治疗的mtHSV免疫鼠和正常鼠比较起来均有显著差异。我们得出结论:体内存在HSV的感染不会削弱反而会增强mtHSV治疗肿瘤的效果。这种结果可能在mtHSV肿瘤临床治疗上有潜在应用价值。为了阐明其中的关系,我们进一步研究了未免疫和HSV血清阳性Balb/c鼠外周血淋巴细胞体外对S-180的细胞毒性作用及PBMC在免疫过程中细胞因子转录水平的变化。IFN-γ产生于抗原激活的T细胞和NK细胞,它扮演了涉及到抗病毒和抗肿瘤功能的免疫调节角色和效应因子功能,包括诱导CTL(cytotoxic T lymphocytes)细胞、NK细胞和吞噬细胞依赖的活性的激活。TNF-α是大多数免疫功能的主要调节分子,是一个细胞毒性作用的单一因子,包括诱导凋亡、肿瘤细胞的裂解、多型核细胞(polymorph nuclear leukocytes,PMN)和抗病毒活性。TRAIL与其它TNF家族成员一样能够诱导其敏感靶细胞凋亡。最近的报道表明TRAIL在激活的人和鼠的T淋巴细胞表面表达,提高了TRAIL对T细胞介导的细胞毒性作用或免疫调节的可能性。未免疫和HSV血清阳性Balb/c鼠的PBMC体外对S-180细胞的细胞毒性实验结果表明野生型HSV血清阳性鼠的PBMC在体外对S-180细胞的细胞毒性达到22.3 %,mtHSV血清阳性鼠的为11.4 %,未免疫鼠的为0.5 %。实验证明HSV免疫小鼠确实诱导产生了肿瘤特异性或非特异性因子,可能包括NK细胞(natural killer cell)和LAK细胞(lymphokine activated killer cell),这些肿瘤特异性或非特异性因子在mtHSV介导的肿瘤治疗中与mtHSV一起协同杀死了肿瘤细胞,HSV-1F免疫小鼠的这种作用强于mtHSV免疫小鼠。HSV血清阳性Balb/c鼠在免疫过程中PBMC的细胞因子转录水平检测实验表明HSV血清阳性鼠PBMC的干扰素gamma转录水平在感染的早期和晚期均显著的升高,晚期达到了本底的4-5倍,而在野生型HSV血清阳性鼠中肿瘤坏死因子alpha的转录水平在感染晚期比本底也升高了1.5倍。干扰素具有广谱的抗病毒活性,表现在病毒繁殖量的减少以及由此而引起的细胞损伤的减少。干扰素的抗病毒作用是抑制,而不是杀灭病毒。不同病毒对干扰素作用的敏感性也不同。据报道IFN-γ通过PKR途径阻止HSV-1复制。但HSV-1编码的三种蛋白质ICP0 , ICP34.5和USll,对IFN抑制病毒复制有明显的抵消作用。ICP34.5与细胞蛋白磷酸酶1结合,能够逆转PKR(蛋白激酶)的活性。USll是RNA结合蛋白,它可以防止PKR的激活。PKR是IFN诱导激酶,它可以抑制蛋白质的合成,主要是通过磷酸化翻译起始因子2 (eIF-2 )起作用。ICPO能够抑制IFN-γ诱导的基因转录,其机制未知。mtHSV虽然缺失了ICP34.5,但它是肿瘤靶向性的,而这些肿瘤细胞的PKR途径都是失活的,因此,IFN-γ不能通过PKR途径来抑制mtHSV在这些肿瘤细胞中的复制。而且IFN-γ抗病毒活性较IFNⅠ型低,但它的免疫调节和抗细胞增殖的作用较强,它是一种强的巨噬细胞、NK细胞、血管内皮细胞活化剂,能激活巨噬细胞并促进其活性;能直接作用于T和B淋巴细胞,促进分化,通过免疫调节来抑制和杀死肿瘤细胞。总之,机体由于预先感染mtHSV或HSV-1F产生的IFN-γ不会抑制随后注射的mtHSV在肿瘤中的复制,反而会由于产生的IFN-γ来调节免疫系统抑制和杀死肿瘤细胞。TNF-α是一种具有广泛生物学效应的淋巴因子。实验表明TNF对多种肿瘤细胞有较强的细胞毒性作用;动物实验显示TNF对小鼠肉瘤、腺瘤均有明显抗瘤效果,特征是引起肿瘤出血性坏死,肿瘤缩小以至消退,肺转移减少和动物存活期延长。TNF抗瘤作用主要机制是:(1)引起肿瘤细胞的凋亡。肿瘤细胞膜TNF受体收到配体的信号后,通过死亡受体途径使肿瘤细胞发生凋亡;(2)对肿瘤细胞的直接细胞毒性。TNF与肿瘤细胞膜TNF受体特异性结合并内吞,与溶酶体结合发生溶酶体破裂,导致细胞自溶;(3)引起肿瘤微血管内皮细胞损伤,血栓形成,导致肿瘤缺血性坏死。IFN-γ可以通过促进肿瘤细胞TNF-α表达,增加TNF受体数量来提高肿瘤细胞对TNF的敏感性。我们得出结论在野生型HSV血清阳性鼠中IFN-γ和TNF-α在抗肿瘤的功能中扮演了比较重要的角色,在mtHSV血清阳性鼠中IFN-γ起着重要作用。mtHSV治疗肿瘤已经被证明是有效的,但是结合其他化疗药物治疗肿瘤还未曾研究。溶瘤病毒联合化疗药物或放疗治疗癌症能够很大程度地提高治疗效果,减少治疗过程中对机体本身的毒副作用。表阿霉素EPI已经在病人身上进行了广泛的研究,并且被证明对肿瘤治疗是有效的。mtHSV和EPI在细胞水平具有协同治疗肿瘤的疗效。我们在Balb/c小鼠左前肢掖下植入肉瘤,然后将mtHSV高浓度,EPI正常剂量,mtHSV中浓度+EPI低剂量或者PBS瘤内注射治疗小鼠,每周一次持续三周。与用PBS,mtHSV或者EPI治疗组相比较,mtHSV+EPI治疗组的小鼠体内肿瘤平均生长率明显受到极大的抑制,肿瘤抑制率达到86.10 %。在实验期间,mtHSV+EPI治疗组,EPI治疗组,mtHSV治疗组,PBS治疗组的小鼠存活率分别是100 %,87.5 %,100 %,25 %。从免疫组织化学和小鼠肿瘤组织病理切片看,mtHSV+EPI治疗组的肿瘤坏死程度最大,PBS治疗组的肿瘤组织仍然是致密的。常规和生化的血液结果表明,EPI对机体有微弱的毒性,但是mtHSV联合EPI治疗肿瘤对机体几乎没有毒性。我们推论:在肿瘤治疗中,低剂量的mtHSV和EPI联合治疗可以协同增强放大二者高剂量单个使用抗肿瘤的效果,在提高肿瘤治疗效果的同时大大降低化疗药物EPI对机体本身的毒副作用性并且mtHSV在肿瘤组织内的复制能力没有被EPI所削弱。