论文部分内容阅读
乳腺癌(Breast cancr,BC)是女性最常见的恶性肿瘤之一,其中HER-2(Human epidermalgrowth factor receptor-2,人表皮生因子受体-2)阴性乳腺癌是最常见的乳腺癌亚型,但是目前对于此类乳腺癌的早期基因表达变化、分子机制和靶向药物选择等方面仍不明确。而且该类亚型的部分患者虽然经过早期治疗预后相对较好,但其较高的复发及转移率仍对患者的健康构成极大威胁,因此,深入研究HER-2阴性乳腺癌发生、发展的相关分子机制,能够为此类乳腺癌的治疗探索新的治疗靶点,对于提高乳腺癌患者的治疗效果以及改善预后都具有非常重要的意义。Micro RNA(miRNA)能够调控基因表达并可以调节细胞的多种生理功能,有望成为治疗恶性肿瘤的潜在靶点。越来越多的证据支持miRNA在乳腺恶性肿瘤中存在表达异常,与肿瘤的发生、发展关系密切。其中miR-519作为目前已知的miRNA基因簇区域拥有重要的生理功能,在多种肿瘤的发生和发展过程中发挥着调控作用。但是miR-519在HER-2阴性乳腺癌中的表达情况以及生物学影响目前仍不十分清楚。因此,为了研究miR-519在HER-2阴性乳腺癌发病中的作用,本文首先检测了HER-2阴性乳腺癌组织中miR-519的表达水平,并分析了其表达水平与临床病理参数的相关性,然后从细胞水平研究了miR-519对HER-2阴性乳腺癌细胞增殖活性的影响,最后通过分析miR-519的下游靶基因,探讨了miR-519对乳腺癌细胞增殖活性影响的分子机制。本文为阐明miR-519对HER-2阴性乳腺癌生物学特征的影响、作用机制以及寻找治疗的新靶点提供了实验基础及理论依据。第一部分miR-519在HER-2阴性乳腺癌组织中的表达及其与临床指标的关系目的:本部分研究旨在研究miR-519在HER-2阴性乳腺癌组织中的表达情况,分析其表达水平与临床病理参数的相关性,为进一步探讨miR-519在乳腺癌发病中的作用机制提供实验依据。方法:收集40例HER-2阴性型乳腺癌组织及癌旁组织,采用real-time PCR检测癌及癌旁组织中miR-519a-3p,miR-519b-3p和miR-519c-3p的表达水平,分析其表达情况及其与患者临床病理参数的相关性。所有数据应用SPSS13.0软件分析,P<0.05有统计学意义。结果:与癌旁组织相比,乳腺癌组织中miR-519a-3p、miR-519b-3p和miR-519c-3p m RNA表达分别降低至30%、40%和50%,且均具有统计学差异(P<0.01);miR-519a-3p,miR-519b-3p和miR-519c-3p的表达水平同肿瘤大小和淋巴结转移相关(P<0.05),同年龄、组织学分级以及激素受体表达情况无关(P>0.05)。结论:miR-519a-3p,miR-519b-3p和miR-519c-3p在HER-2阴性乳腺癌组织中表达水平降低,且表达水平与肿瘤大小和腋窝淋巴转移明显相关,提示miR-519可能参与了乳腺癌发病过程。第二部分miR-519对HER-2阴性乳腺癌细胞增殖的影响目的:本部分研究在第一部分研究的基础上,旨在探讨miR-519对HER-2阴性乳腺癌细胞增殖能力的影响。方法:1.在MCF-7和MDA-MB-231细胞中转染miR-519 mimics或miR-519inhibitors,利用real-time PCR检测MCF-7和MDA-MB-231细胞中miR-519水平;2.采用MTT法和克隆形成试验检测乳腺癌细胞的增殖水平。结果:1.转染miR-519 mimics的MCF-7和MDA-MB-231细胞中miR-519a-3p,miR-519b-3p和miR-519c-3p表达水平均明显升高3-7倍,且具有统计学意义(P<0.01);2.转染miR-519inhibitors的MCF-7和MDA-MB-231细胞中miR-519a-3p,miR-519b-3p和miR-519c-3p表达水平均降低至20-50%,且具有统计学意义(P<0.01);3.在MCF-7和MDA-MB-231细胞中上调miR-519水平能够抑制乳腺癌细胞增殖;4.在MCF-7和MDA-MB-231细胞中下调miR-519水平能够促进乳腺癌细胞增殖。结论:miR-519能够调节HER-2阴性乳腺癌细胞的增殖活性。第三部分探讨miR-519下游靶基因目的:探索miR-519调节HER-2阴性乳腺癌细胞增殖的下游靶基因,为探明miR-519调节HER-2阴性乳腺癌细胞增殖的分子机制提供理论基础。方法:1.通过生物信息学分析,寻找miR-519的下游靶基因;2.通过luciferase activity assay验证miR-519能够与下游靶基因结合;3.在MCF-7和MDA-MB-231细胞中转染miR-519 mimics,利用Western Blot方法检测下游HUR、BCL-2和BAX蛋白水平;4.在MCF-7和MDA-MB-231细胞中转染miR-519 inhibitors,利用Western Blot方法检测下游基因HUR、BCL-2和BAX蛋白水平;5.检测人HER-2阴性乳腺癌组织中HUR、BCL-2和BAX蛋白水平。结果:1.经生物信息学分析HUR(Human antigen R RNA,结合蛋白人类抗原R)是miR-519的下游靶基因;2.luciferase activity assay结果显示miR-519能够直接结合在HUR m RNA 3’-UTR上;3.在MCF-7和MDA-MB-231细胞中过表达miR-519下调HUR和BCL-2蛋白水平,上调BAX蛋白水平;4.在MCF-7和MDA-MB-231细胞中中低表达miR-519上调HUR和BCL-2蛋白水平,下调BAX蛋白水平;5.人HER-2阴性乳腺癌组织中HUR和BCL-2蛋白水平升高,BAX蛋白水平降低。结论:HUR是miR-519的下游靶基因。第四部分miR-519/HUR对HER-2阴性乳腺癌细胞增殖的影响目的:本部分研究旨在探讨miR-519通过HUR影响HER-2阴性乳腺癌细胞增殖的分子机制,为开展HER-2阴性乳腺癌的基因治疗提供理论基础。方法:1.在MCF-7和MDA-MB-231细胞中转染si-HUR抑制HUR蛋白表达,利用Western Blot检测BCL-2和BAX蛋白水平;2.在MCF-7和MDA-MB-231细胞中共转染si-HUR和miR-519inhibitor,利用Western Blot检测HUR、BCL-2和BAX蛋白水平;利用MTT法和克隆形成试验检测乳腺癌细胞的增殖水平。结果:1.在MCF-7和MDA-MB-231细胞中转染si-HUR,HUR及BCL-2蛋白水平降低,BAX蛋白水平升高;2.沉默HUR能够逆转miR-519 inhibitors促进HER-2阴性乳腺癌细胞增殖的作用。结论:miR-519通过HUR调节HER-2阴性乳腺癌细胞的增殖。