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第一部分LKB1在肝门部胆管癌中的表达及其与临床预后关系的分析研究背景和目的:肝门部胆管癌(Hilar Cholangiocarcinoma,HC)是胆道最常见的恶性肿瘤之一,占胆道肿瘤的60%。近年来发病率逐年上升。临床上,手术切除仍然是HC的首选治疗手段。但手术要求高,难度大,导致了只有小部分患者获得手术切除的机会。即使能获得根治性手术,其术后早期复发,肝内,淋巴结及远处转移仍然是影响患者生存的主要因素。所以寻找可行有效的非手术干预治疗手段是改善HC患者生存的唯一途径。研究表明,肝激酶B1(Liver kinase B1,LKB1)基因的缺失能够显著的促进肿瘤的生长与转移。多项研究表明,人体多种肿瘤中发现LKB1的缺失对疾病的进展速度和患者的预后有着明显的影响,这可能是LKB1缺失激活了下游的某些信号通路促进了肿瘤的生长与转移。但是,目前对于LKB1缺失促进肿瘤进展的分子机制,还有很多问题亟待研究澄清,如LKB1在肿瘤中的缺失是以何种机制为主,以基因的丢失,基因的甲基化,基因的突变? LKB1缺失以后是如何激活下游信号通路,进而影响肿瘤的生物学行为?深入研究LKB1调控癌细胞生长的分子机制,有可能为肝门部胆管癌等恶性肿瘤提供有效的治疗靶点。在本研究的第一部分,我们拟首先选取合适的肝门部胆管癌组织样本制作组织芯片,利用组织芯片检测LKB1在肿瘤组织中的表达情况。研究方法:在得到患者知情同意之后,收集手术切除的新鲜标本,同意病人标本一部分用福尔马林固定,包埋蜡块用来制作组织芯片;针对符合入组标准的患者,明确病例诊断后,完善患者临床病例资料,密切定期随访,建立完整的临床数据资料库。利用组织芯片,用免疫组化方法检测LKB1蛋白在肝门部胆管癌组织中的表达,制定染色评分标准,对LKB1表达强度进行量化评估。运用JMP9,用Kaplan Meier生存分析和COX风险比例模型来分析LKB1与患者总体预后的关系,明确LKB1在肝门部胆管癌进展中的作用。结果:1、在327例肝门部胆管癌组织芯片中,260例(80%)癌组织中检测到LKB1的表达呈不同程度的降低;LKB1在癌组织中的表达与患者的年龄相关,年龄越大, LKB1降低的比率越高(P<0.05),还与分化程度、淋巴结转移、TNM分期相关;2、单因素及多因素生存分析提示LKB1的低表达与肝门部胆管癌患者的差预后相关,是肝门部胆管癌的独立预后因素之一;结论:1、LKB1在80%肝门部胆管癌组织中表达不同程度降低;2、LKB1的表达水平与肝门部胆管癌患者预后呈显著负相关,LKB1有可能成为反映肝门部胆管癌预后的一个重要指标。第二部分LKB1表达缺失的机制及对细胞生物学行为的影响背景与目的:Lkb1在肿瘤发生发展中的作用已经逐渐被揭示。在前期探索LKB1调节功能的研究中,发现LKB1主要通过LKB1/AMPK/mTOR通路来发挥其肿瘤抑制基因的功能。在第一部分中,我们已经发现LKB1在肝门部胆管癌中的表达在80%的组织中呈不同程度的减低。而且预后分析发现LKB1的低表达与患者的总体生存时间呈显著相关性。但是,LKB1在肝门部胆管癌组织中表达降低的机制还不明确。揭示LKB1表达缺失的机制,明确LKB1基因缺失对肝门部胆管癌细胞生物学功能的影响及其机制,并研究LKB1/AMPK通路在肝门部胆管癌靶向治疗中的应用。方法:1.利用组织芯片,采用荧光原位杂交(FISH)技术检测LKB1等位基因的丢失。设计双色荧光探针,红色荧光代表LKB1基因,绿色荧光代表染色体的中心粒。正常情况下应该观察到两个红色和两个绿色探针。如果只观察到一个红色探针,说明LKB1为杂合性丢失,如果没有红色探针,说明LKB1为纯合性丢失。2.运用JMP9,用Kaplan Meier生存分析和COX风险比例模型来分析LKB1的丢失与患者总体预后的关系,明确LKB1在肝门部胆管癌进展中的作用。3.体外观察LKB1对胆管癌细胞系生物学行为的影响:用LKB1siRNA和ControlsiRNA分别转染LKB1完整的胆管癌细胞系,用MTT,划痕实验和Transwell实验来观察沉默LKB1对肿瘤细胞增殖,迁移和侵袭能力的影响。4.体外观察LKB1对胆管癌细胞药物敏感性的影响:用LKB1siRNA和ControlsiRNA分别转染LKB1完整的胆管癌细胞系,观察二甲双胍(Matformin)和苯乙双胍(Phenformin)诱导细胞凋亡的情况。结果:1、FISH检测发现近38%的肝门部胆管癌组织中LKB1呈不同形式的等位基因的缺失;2、沉默LKB1以后,胆管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显增强;3、沉默LKB1以后,苯乙双胍可以显著诱导胆管癌细胞凋亡,而二甲双胍则不明显。结论:LKB1的缺失在肝门部胆管癌中是一个普遍现象,它的缺失与肝门部胆管癌临床预后差呈明显的相关性,LKB1低表达会增强肿瘤细胞的转移潜能,LKB1可能为指导临床治疗的重要指标。LKB1/AMPK/mTOR通路可能成为肝门部胆管癌治疗的潜在靶点,针对LKB1缺失的胆管癌患者,苯乙双胍可能成为有效的治疗药物。