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随着哺乳动物遗传与发育的深入研究,体外受精、体细胞核移植、诱导多能性干细胞和转基因等生物技术迅速发展,动物卵子和胚胎因体外研究需求数量大规模増加,卵子与胚胎的长期、均衡供应显得非常重要,冷冻保存技术对解决这一问题提供了便利。特别是配子的冷冻保存,不仅可以跨越时间与空间的限制,提供充足的配子与胚胎来源,而且有利于优良种质资源的交流和生物多样性的维持。但是,近年来的研究表明,玻璃化冷冻不仅会对细胞的细胞膜、线粒体等超微结构造成损伤,还会对卵母细胞或者胚胎的DNA甲基化水平、组蛋白的修饰和印记基因的表达产生影响,阻碍胚胎的正常发育。白藜芦醇是一种多酚类物质,具有多种生物活性,如抗氧化、抗肿瘤和抗衰老等作用。最近研究表明,白藜芦醇还可在表观遗传修饰上调控基因的表达,参与基因组DNA甲基化和组蛋白修饰等。本研究使用Cryotop玻璃化冷冻方法,通过在对小鼠MII期卵母细胞的玻璃化冷冻液和解冻液中同时添加白藜芦醇,旨在提高卵母细胞的冷冻效率和胚胎发育潜力,并对异常的表观遗传修饰加以改善。本研究使用TUNEL染色、免疫荧光染色和qRT-PCR等方法,分析了白藜芦醇对冷冻后的MII期卵母细胞中DNA甲基化水平、组蛋白H3K9乙酰化水平、去乙酰化酶SIRT1的表达水平和囊胚质量的影响,并使用亚硫酸氢盐测序法,检测了白藜芦醇对2-cell和囊胚中印记基因PEG3和GTL2的差异甲基化状态。获得了以下研究结果:1.在卵母细胞玻璃化冷冻-解冻过程中,添加白藜芦醇可以明显改善卵母细胞的发育潜能。本研究在卵母细胞冷冻和解冻液中,分别添加2μM白藜芦醇,研究发现,冷冻添加白藜芦醇组的受精率(63.8%)高于冷冻未添加白藜芦醇组(42.9%)(P<0.05),但仍显著低于未冷冻组(85.8%)(P<0.05),三组间卵裂率统计没有明显差异(P>0.05),冷冻添加白藜芦醇组的囊胚率(68.3%)显著高于冷冻未添加白藜芦醇组(50.2%),与未冷冻组(74.1%)无显著差异(P>0.05);囊胚凋亡染色显示,冷冻添加白藜芦醇组与冷冻未添加白藜芦醇组的凋亡率存在显著差异(P<0.05),但凋亡率与未冷冻组之间差异不显著(P>0.05);冷冻添加白藜芦醇组的囊胚细胞总数和内细胞团细胞数显著高于冷冻未添加白藜芦醇组(P<0.05),与未冷冻组之间无明显差异(P>0.05)2.添加白藜芦醇冷冻卵母细胞可以改善卵母细胞细胞的表观修饰状态。本研究表明,卵母细胞冷冻未添加白藜芦醇组的去乙酰化酶SIRT1的表达水平和5mC水平均显著降低(P<0.05),H3K9乙酰化水平显著升高(P<0.05),冷冻添加白藜芦醇组的5mC水平、组蛋白H3K9乙酰化水平和SIRT1的表达水平得到明显改善,与未冷冻组之间无明显差异(P>0.05)。冷冻未添加白藜芦醇组印记基因PEG3和GTL2的表达水平显著低于未冷冻组(P<0.05),添加白藜芦醇后则与未冷冻组无明显差异(P>0.05)。卵母细胞体外受精后,对2-cell和囊胚的印记基因PEG3和GTL2的差异甲基化区域(DMR)甲基化状态进行检测发现,冷冻未添加白藜芦醇组囊胚期的GTL2差异甲基化区域甲基化水平显著低于未冷冻组(P<0.05),冷冻添加白藜芦醇组而与未冷冻组无明显差异(P>0.05);冷冻未添加白藜芦醇组囊胚的PEG3差异甲基化区域甲基化水平显著高于未冷冻组(P<0.05),而冷冻添加白藜芦醇组与未冷冻组之间无明显差异(P>0.05)。综上所述,在玻璃化冷冻过程中添加白藜芦醇之后,能够明显提高卵母细胞的受精率和囊胚率,降低囊胚凋亡率;添加白藜芦醇能够恢复冷冻后小鼠MII期卵母细胞的5mC水平、组蛋白H3K9乙酰化水平和SIRT1的表达水平,并且能够改善囊胚期印记基因PEG3和GTL2差异甲基化区域的甲基化状态。