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半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)是生物体内能够抑制半胱氨酸蛋白水解酶活性的一类蛋白。尽管cystatin基因已经在许多植物(包括拟南芥、水稻、大麦、大豆、马铃薯、小麦等)中得到了分离和鉴定,但关于苹果cystatin家族基因的生物学功能方面的研究未见报道。本研究利用已公布的苹果基因组数据库,系统鉴定了苹果基因组中所有的cystatin基因,并进一步对它们进行了分类、染色体定位、内含子-外显子结构分析、系统进化、启动子元件分析以及在苹果不同组织的表达模式分析,同时检测了cystatin基因在干旱、低温、高温、脱落酸(ABA)、氧化胁迫等不同的非生物胁迫下的表达情况。在此基础上对苹果属植物‘富平楸子’(Malus prunifolia)MpCYS2、MpCYS4和MpCYS5基因的抗逆生物学功能进行了研究。所获得的主要结果如下:1.在苹果基因组中鉴定到26个cystatin家族基因成员,分布在苹果的9条染色体上,这些基因编码的蛋白质含有cystatin保守的特征结构域。系统进化分析表明植物中的cystatin基因可以分为4个亚族,而苹果cystatin基因主要聚类到其中的3个亚族。对cystatin基因在不同组织的表达模式分析表明,选取的8个cystatin基因在楸子的根、茎、叶、花和种子中表现出组成型表达。在叶片的成熟、衰老过程以及不同非生物胁迫处理后的实时荧光定量PCR分析表明,该家族基因可能参与苹果属植物生长发育、叶片衰老以及抵御非生物胁迫过程。随后,从楸子成熟叶片中克隆得到5个cystatin基因(MpCYS1、MpCYS2、MpCYS3、MpCYS4、MpCYS5),它们均含有高度保守的cystatin结构域。2.MpCYS2基因的表达受到干旱、MV及外源ABA的诱导。亚细胞定位分析表明,MpCYS2基因主要定位于洋葱表皮细胞的细胞核、细胞膜和细胞质。拟南芥异源表达MpCYS2可以促进渗透胁迫及氧化胁迫下种子的萌发和籽苗的生长。同时,干旱胁迫下转基因植株抗性更强,表现为叶片电导率更低、叶绿素含量更高、丙二醛积累量更低。脱水处理下,转基因植株体内活性氧(ROS)的积累量较少。另外,MpCYS2基因过量表达也影响了渗透胁迫下根毛的发育。这些研究结果表明,MpCYS2影响干旱胁迫下转基因植株的生长和耐旱性可能是通过影响植株体内ROS的积累和根毛的发育来实现的。3.MpCYS4基因的表达受到干旱、高温、MV及外源ABA的诱导,在叶片衰老过程中该基因的表达量也明显提高。亚细胞定位分析表明,MpCYS4主要定位于洋葱表皮细胞的细胞核、细胞膜和细胞质。并且,MpCYS4体外纯化的融合蛋白对木瓜蛋白酶的活性具有抑制效果。MpCYS4基因在拟南芥和苹果矮化砧木‘M26’中过量表达后,导致植株对ABA超敏感和其他一系列ABA相关的表型,如促进了ABA诱导的气孔关闭过程,改变了很多ABA和胁迫响应基因的表达,并且提高了植株对干旱胁迫的抗性。这表明,MpCYS4可能参与了ABA信号传递过程,通过促进干旱胁迫下气孔的关闭,调节ABA和干旱响应基因的表达,提高植株的抗旱性。4.MpCYS4基因也可以影响苹果叶片自然衰老以及胁迫诱导的衰老过程中叶片的光合能力和叶片蛋白的含量和组成。其在苹果矮化砧木‘M26’中过量表达后,能够有效延缓叶片衰老过程中光合能力的下降和叶绿素的降解,抑制半胱氨酸蛋白酶的活性,延迟叶片蛋白质(尤其是Rubisco)的降解。而且,MpCYS4通过影响过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)等抗氧化酶的活力,提高ROS的清除能力,缓解衰老过程中的氧化损伤,保护植物细胞免受自由基的伤害。因此,MpCYS4不仅在苹果非生物逆境胁迫应答中具有重要功能,在苹果叶片衰老过程中也发挥重要作用。5.通过酵母双杂交试验,我们筛选到与MpCYS4互作的蛋白MpFER。利用双分子荧光互补技术(BiFC)进一步发现,MpCYS4与MpFER的相互作用主要发生在细胞膜上。MpFER编码一个类受体蛋白激酶(RLK),与拟南芥FER高度同源。体外磷酸化试验表明,MpFER的活性受到MpCYS4的影响。亚细胞定位分析表明,MpFER主要定位在细胞膜上。MpFER的表达也受到干旱和外源ABA的诱导,MpFER基因导入拟南芥功能缺失突变体fer-4,可以恢复其对ABA超敏感的表型。因此,MpCYS4可能通过与MpFER互作参与苹果干旱胁迫应答过程。6.MpCYS5基因的表达受到盐胁迫的诱导。MpCYS5体外纯化的融合蛋白可以抑制木瓜蛋白酶的活性。该基因在拟南芥中异源表达可以提高植株对盐胁迫的抗性,表现为盐胁迫下转基因植株的叶片电导率更低、叶绿素含量更高、丙二醛积累量更低。同时,MpCYS5可以影响盐胁迫下植株体内ROS的含量和抗氧化酶的活力。另外,该基因也参与调控衣霉素诱导的内质网胁迫以及未折叠蛋白应答(UPR)过程。通过检测UPR响应基因的表达我们发现,衣霉素处理下这些基因的表达在野生型中被显著诱导,而在转基因植株中没有出现明显变化。这表明,MpCYS5在拟南芥中异源表达后,植株同时表现出了对盐胁迫和对衣霉素诱导的内质网胁迫的抗性。