膝骨关节炎是我国乃至世界范围内中老年的常见病之一,其发生发展的过程与年龄,体重,创伤,运动习惯,地理环境等诸多因素密切相关[1]。病变过程包括关节软骨的磨损,韧带的退变,周围滑膜的炎症等多种病理性改变[2]。膝骨关节炎的发生,给广大患者造成了日常生活中的极大痛苦与不便。据统计,我国60周岁以上的人群中,其中65岁以上人群发病率超过50%,75岁以上人群则高于80%[3]。江苏省中医院黄桂成教授在治疗此类疾病时,认为其发病机理包含了风、寒、湿三种致病因素侵袭肌理,从而造成局部的疼痛、肿胀、运动障碍。在治疗过程中运用祛风散寒、温通经脉、活血止痛等方法,往往能达到药到病除的效果。骨关节炎机制研究中发现,在膝骨关节炎的发生发展过程中,伴随着软骨下骨中血管的增生与侵袭,血管侵袭软骨后造成了软骨的破裂、缺损、变形等诸多病理变化。软骨组织受不间断的刺激下分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),早期诱导内皮细胞增殖并向软骨部分定向移动及侵袭。与此同时,软骨组织因受持续刺激而进一步分泌基质金属蛋白酶-13(MMP13)等蛋白酶,从而为血管侵袭开辟新的组织间隙。动物模型试验表明,在KOA病变的早期,软骨下骨中血管生成活动较健康组织更加频繁,并出现血管侵入骨-软骨连接处的现象。血管的新生和感觉神经的生长紧密联系,伴随着血管数量的增加,交感神经以及感觉神经从软骨下骨中延伸到骨-软骨通道中,是骨关节炎早期疼痛的基础,并提高了血管通道内神经生长因子的表达。在KOA疾病的发生发展阶段,软骨下骨重建异常以及新生血管数量的增加、微裂缝的形成,促进了分子信号在骨-软骨间的转位和交互作用。这些信号通路的激活和分泌因子的释放,在细胞和分子的交互作用中起到了关键的调节作用。据此,本研究的顺利进行,为观察“温经通络汤”对VEGF的影响提供实验基础。基于第一部分实验的成功,我们开展了第二部分实验,即观察“温经通络汤”能否抑制小鼠膝关节软骨中HIF1 α、VEGF、MMP13的表达。其中缺氧诱导因子-1 α(HIF1 α)的过度分泌将导致VEGF表达情况的增加。VEGF作为血管新生的调节因子,其在骨关节炎疾病进程中起到了关键的作用,决定着新生血管从骨-软骨交界处向软骨层侵入的发生过程。而伴随着软骨内的血管侵入,则将直接造成病变软骨的断裂,分离,剥脱等一系列病理表现。因此有效地抑制VEGF的表达,将有助于延缓膝骨关节炎中关节表面软骨的破坏进程。基于感觉神经往往伴随于新生血管,而感觉神经的过度刺激是膝骨关节炎疼痛的内在原因之一,那么当“温经通络汤”有效抑制了血管侵袭软骨的进程之后,是否能够进一步降低膝骨关节炎的相关炎性因子的分泌呢?结果显示:“温经通络汤”的确能够有效抑制小鼠膝关节中HIF1 α与VEGF的表达,从而减缓膝关节软骨的退变过程,并进一步降低其中MMP13的表达情况。为明确“温经通络汤”是通过何种途径作用于病变组织的,我们开展了第三部分的实验,该部分实验中我们用酶联免疫吸附实验检测了各组小鼠血清中的HIF1 α、VEGF、MMP13的表达情况,发现其与各组小鼠膝关节软骨中的表达情况存在一定的关联性,同时为后续体外实验打下基础。笔者认为:中药复方“温经通络汤”能够显著抑制小鼠血清及膝关节软骨中HIF1 α、VEGF、MMP13的表达,从而减缓骨-软骨连接处的血管新生及其向膝关节软骨内的侵袭过程,并以此达到维持关节软骨的机构完整性,延缓KOA的发生发展。小鼠膝骨关节炎的造模:目的:完善造模方法,造模完成后通过大体观察和HE染色等实验方法来鉴定造模是否成功,为后续实验做准备。方法:通过前交叉韧带离断(ACLT)造模方法,以达到小鼠膝骨关节炎的造模效果,造模后继续饲养4周,期间不采取其他特殊干预措施,4周后取材,并大体观察造模后小鼠膝关节表面的结构变化,通过HE切片染色观察造模后小鼠的关节软骨和软骨下骨等结构的组织学形态。结果:造模成功后,大体观察显示空白组和假手术组小鼠的膝关节表面结构未发生明显变化,模型组小鼠的膝关节表面出现局部增生、裂痕、剥脱等病理变化。HE切片染色显示空白组和假手术组小鼠的膝关节表面软骨结构完整,软骨和软骨下骨之间界限明显,潮线清晰。模型组小鼠膝关节软骨出现裂缝、分离,且骨-软骨界限不明显,未见明显潮线。结论:通过前交叉韧带离断(ACLT)造模方法造模后,结果满意,可用于后续实验。“温经通络汤”对小鼠膝关节软骨中HIF1 α、VEGF、MMP13的抑制作用:目的:观察中药复方“温经通络汤”对小鼠膝关节中VEGF的影响。方法:制备中药复方“温经通络汤”的高浓度和低浓度水煎液并浓缩处理,以美洛昔康作为阳性药对比。将实验动物分为五组:假手术组(A组)、模型组(B组)、温经通络汤高剂量组(C组)、温经通络汤低剂量组(D组)、阳性药组(E组)。其中造模成功后A组与B组分别予以10ml/kg·d-1生理盐水灌胃,C组与D组分别予以10ml/kg·d-1温经通络汤灌胃,E组予以10ml/kg·d-1美洛昔康水溶液灌胃,持续2周。灌胃结束后采用免疫组化和酶联免疫吸附实验方法检测小鼠膝关节软骨中HIF1 α、VEGF、MMP13的表达情况。结果:灌胃2周后,免疫组化实验结果显示:高剂量组、低剂量组和阳性药组中小鼠膝关节软骨中的HIF1 α、VEGF、MMP13表达相较于模型组均有明显下降,其中阳性药组的HIF1 α、VEGF、MMP13表达最低,接近于假手术组的水平。低剂量组、高剂量组和阳性药组的HIF1 α、VEGF、MMP13表达呈递减趋势,差异均具有统计学意义。酶联免疫吸附实验结果显示:与假手术组相比,其余各组的小鼠膝关节中HIF1 α、VEGF、MMP13的表达均有明显升高,其中模型组小鼠膝关节中HIF1 α、VEGF、MMP13的表达最高,低剂量组、高剂量组和阳性药组与模型组相比均有下降,差异具有统计学意义。结论:“温经通络汤”对于小鼠膝骨关节炎病程中膝关节软骨内的HIF1 α、VEGF、MMP13表达具有明确的抑制作用。其有效干预膝骨关节炎的发展进程,抑制炎症反应,延缓膝关节软骨的退化机制可能与此相关。“温经通络汤”对小鼠血清中HIF1 α、VEGF、MMP13的抑制作用:目的:观察中药复方“温经通络汤”对小鼠血清中HIF1 α、VEGF、MMP13影响。方法:制备中药复方“温经通络汤”的高浓度和低浓度水煎液并浓缩处理,以美洛昔康作为阳性药对比。将实验动物分为五组:假手术组(A组)、模型组(B组)、温经通络汤高剂量组(C组)、温经通络汤低剂量组(D组)、阳性药组(E组)。其中造模成功后A组与B组分别予以10ml/kg·d-1生理盐水灌胃,C组与D组分别予以10ml/kg·d-1温经通络汤灌胃,E组予以10ml/kg·d-1美洛昔康水溶液灌胃,持续2周。灌胃结束后采用免疫组化和酶联免疫吸附等实验方法检测小鼠血清中HIF1 α、VEGF、MMP13的表达情况。结果:灌胃2周后,酶联免疫吸附实验结果显示:与假手术组相比,其余各组的小鼠血清中HIF1 α、VEGF、MMP13的表达均有明显升高,其中模型组小鼠血清中HIF1 α、VEGF、MMP13的表达最高,高剂量组、低剂量组和阳性药组与模型组相比均有下降,差异具有统计学意义。结论:“温经通络汤”能够通过调控小鼠膝血清中HIF1 α、VEGF、MMP13表达情况,从而达到进一步抑制小鼠膝关节软骨中相关因子的表达,延缓膝骨关节炎病程的发展,抑制膝骨关节炎中炎性因子的表达。