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肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是一种常见的机会性病原体,可导致人类高发病率和高死亡率。滥用抗生素已导致多耐药肺炎克雷伯菌菌株的迅速增加。因此,迫切需要可以替代常规抗生素的新型替代抗菌剂以控制由耐药菌引起感染。这项研究旨在表征两种广谱新型噬菌体,并检查不同荚膜型噬菌体鸡尾酒对小鼠肺炎克雷伯菌感染的功效和安全性。本研究从中国的几家医院共获得180株临床肺炎克雷伯氏菌,通过基于16S r RNA基因的聚合酶链反应(PCR)鉴定了肺炎克雷伯菌。根据Pan描述的方法鉴定所有肺炎克雷伯菌菌株的荚膜类型。将菌株在的LB(Luria-Bertani)培养基中37℃培养。选择了两个具有广泛耐药菌株(菌株KP1183和KP2381),并进一步用于小鼠实验。使用KP1183和KP2381作为宿主菌株分别分离到了噬菌体vB＿KpnP＿IME304(IME304)和vB＿KpnP＿IME335(IME335)。制备了由噬菌体IME304和IME335组成的鸡尾酒,用于进一步研究。通过向噬菌体裂解物中添加10%PEG8000和1 M Nacl,沉淀法获得的高滴度和纯的噬菌体。通过透射电子显微镜(TEM)(Janpan,JEM-1200EX)进一步观察和鉴定噬菌体的形态。为了确定噬菌体的稳定性,进行了温度和pH稳定性的测试实验。使用时间杀伤实验进一步阐明了噬菌体杀菌能力的定量分析。使用Illumina Miseq(San Diego,CA,USA)对噬菌体基因组进行测序。使用Newbler 3.0汇编程序组装基因组。使用子系统技术(RAST)的快速注释对开放阅读框(ORF)进行注释。基因组图谱是使用CLC Genomics Workbench 3.0生成的。使用Easyfig 2.0进行噬菌体蛋白质基因组比较。抗菌素耐药性和细菌毒力因子由Res Finder确定。系统进化树是使用MEGA 6.0中的1000个bootstrap重复项的Neighbor-joining方法构建的。为了检查噬菌体鸡尾酒对治疗的保护作用,将先前纯化的IME304和IME335分别调整为1×10~9 CFU/mL的噬菌体滴度,并通过将两种噬菌体等比例混合制备成鸡尾酒,然后用于小鼠治疗实验。为了进一步研究小鼠是否能有效清除肺炎克雷伯菌和噬菌体,如前所述,将100只BALB/c小鼠分为5组。每天解剖每组三只小鼠,然后计数三个器官中的细菌载量和噬菌体计数。为了更好的理解噬菌体鸡尾酒是否引起小鼠免疫反应,每天将噬菌体鸡尾酒腹膜注射法引入小鼠体内,共7天。对照组用PBS缓冲液治疗。处死小鼠取出肝,脾和肺以进行组织病理学观察;获得小鼠血清用于进一步分析。使用小鼠免疫球蛋白IgE(IgE)ELISA试剂盒(China,Living)确定IgE曲线,使用小鼠组胺ELISA试剂盒(China,Living)检测小鼠血清组胺含量。从中国的几家医院收集了总共180株肺炎克雷伯菌并进行荚膜分型。结果表明,这些菌株共聚集为8种荚膜类型,K47为优势荚膜类型(101/180;101株K47荚膜型菌株中有58株对碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯氏菌),其次是K64(34/180;在34株K64荚膜型菌株中可获得24株对碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌菌株),K15(11/180),K10(7/180),K23(6/180),K24(5/180),K25(10/180)和K28(6/180)。以上荚膜类型的结果表明,在研究的中国医院中,K47和K64型荚膜是最流行的菌株。根据荚膜分型结果的数据,K47和K64是180株中两个主要的流行肺炎克雷伯氏菌荚膜型菌株。然后将这些菌株分别添加到中国人民解放军总医院第五医学中心采取的污水中。因此,典型的菌株KP1183(K47)和KP2381(K64)被用作宿主菌株来筛选噬菌体。分离并命名了两个新型的噬菌体,vB＿KpnP＿IME304(简称为IME304,宿主菌株KP1183)和vB＿KpnP＿IME335(简称为IME335宿主菌株KP2381)。与宿主菌株纯化五代后,IME304和IME335噬菌体均在双琼脂平板上形成透明的圆形噬菌斑,在双琼脂平板上具有清晰的边界。透射电子显微镜和系统发育分析表明,这两株噬菌体均为Autographivirinae亚科的KP32virus。进行了一步生长实验以确定噬菌体的潜伏期和爆发大小。两种噬菌体均具有较短的潜伏期和较大的爆发量,并且具有宽的裂解谱。生物学特性测试表明它们的温度和pH耐受范围;体外时间杀灭实验表明,噬菌体及其鸡尾酒均具有很强的杀菌能力,在100min内将对数相细菌的数量迅速降至0。使用Illumina Miseq平台对IME304和IME335噬菌体的整个基因组进行测序(Gen Bank登录号分别为MK795385和MN176574)。他们的基因组分别是40,746bp和40,361bp,均为线性双链DNA分子。IME304和IME335的基因组排列与KP32,vB＿KpnP＿IME205和K30噬菌体基因组高度同源,没有观察到明显的重排。在体内实验中,噬菌体鸡尾酒治疗小鼠的存活率明显高于未治疗小鼠。特别的是,使用噬菌体鸡尾酒治疗的小鼠能让你能有效清除小鼠肝脏,肾脏和脾脏中的细菌。此外,评估了噬菌体鸡尾酒在小鼠体内的安全性,用噬菌体鸡尾酒治疗小鼠的血清TBIL,AST,ALT,ALP,Cr,BUN和LDH含量正常,肝脏,脾脏或肺部无明显的组织病理学改变,炎性改变仅略有增加。这些结果表明,两种不同的荚膜型噬菌体鸡尾酒是治疗肺炎克雷伯菌感染的潜在候选者。总之,本实验分离出两种不同荚膜型肺炎克雷伯菌噬菌体。生物学分析表明两株噬菌体在高于人体温度的温度下活性稳定,并具有良好的pH稳定性。动物实验表明,噬菌体鸡尾酒对肺炎克雷伯菌感染的小鼠治疗是有效且安全的,证明了两株噬菌体是抗生素可行的替代品,并且可以扩大当前治疗临床感染的选择。因此,该实验证实了这两株新型的噬菌体鸡尾酒具有巨大的潜力,可以作为抗生素替代品和用作医疗消毒剂。