【摘 要】
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目的脑出血血肿周围区域里有大量神经元处于存活-凋亡临界点。研究发现,内质网应激蛋白Herp在机体内环境紊乱时可介导细胞的存活,对脑出血后血肿周围域神经元的损伤具有调节作用,但具体的机制尚不明确。课题组通过质谱分析发现神经营养因子受体p75NTR能够与Herp相互作用,为了探索p75NTR/Herp促凋亡/存活的具体机制,我们针对这两个蛋白分子进行深入研究。方法首先在整体水平,进行小鼠脑出血模型的构
【基金项目】
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国家自然科学基金（81873742）； 江苏省研究生科研与实践创新计划（SJCX190864）“Herp介导脑出血后血肿周围域神经元自噬-凋亡机制的研究与临床应用”；
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目的脑出血血肿周围区域里有大量神经元处于存活-凋亡临界点。研究发现,内质网应激蛋白Herp在机体内环境紊乱时可介导细胞的存活,对脑出血后血肿周围域神经元的损伤具有调节作用,但具体的机制尚不明确。课题组通过质谱分析发现神经营养因子受体p75NTR能够与Herp相互作用,为了探索p75NTR/Herp促凋亡/存活的具体机制,我们针对这两个蛋白分子进行深入研究。方法首先在整体水平,进行小鼠脑出血模型的构建。接着对造模进行评估,是否成功的标准采用两种实验判断1.前肢放置实验2.轮转实验。对小鼠脑组织进行筛选,选取其中的血肿周围组织来进行实验。通过蛋白免疫印迹实验进行p75NTR和Herp的检测工作,重点选取小鼠脑出血后血肿周围区域来分析两种蛋白的表达情况。运用免疫荧光技术,对p75NTR、Herp以及神经元进行定位检测。在正常小鼠脑组织以及脑出血后脑组织样本中通过免疫共沉淀的方法,检测p75NTR和Herp的相互作用情况及脑出血前后其相互作用情况的变化。构建SY5Y细胞血红素刺激模型,在刺激后相应的时间点提取细胞蛋白,调节蛋白浓度,待蛋白浓度一致后进行蛋白免疫印迹实验,检测p75NTR和Herp在刺激前以及刺激后不同时间点的表达情况;通过免疫荧光,检测p75NTR和Herp的定位情况。在293T细胞上转染p75NTR、Herp的全长质粒及其片段的质粒,检测p75NTR和Herp相互作用的情况及其相互作用的具体片段;转染泛素化的质粒,检测p75NTR与Herp的泛素化之间的关系。提取孕15天胎鼠的原代皮层神经元,病毒感染神经元,检测p75NTR以及Herp之间的调控关系。慢病毒过表达/干扰p75NTR/Herp表达的情况下,运用蛋白免疫印迹法检测caspase的表达,进而验证神经元凋亡情况的变化;运用Tunel染色以及流式细胞术检测细胞凋亡情况的变化。结果在小鼠脑出血模型以及血红素刺激SY5Y的细胞模型中,血肿周围以及细胞蛋白中p75NTR和Herp在脑出血/血红素刺激后,表达明显增强;p75NTR与Herp共定位并且p75NTR主要定位于神经元而非胶质细胞;脑出血前后,p75NTR与Herp均存在相互作用并且脑出血后两者相互作用增强;质粒转染293T细胞中,主要是p75NTR的胞外域段的CRD结构域与Herp的泛素类似域相互作用;p75NTR通过促进Herp的泛素化降解使Herp表达减少;血红素刺激原代皮层神经元中,干扰p75NTR/过表达Herp的表达后,神经元凋亡明显减少。结论1.脑出血后,p75NTR与Herp表达均增加且两者主要表达于神经元。2.Herp通过抑制caspase-3介导脑出血后血肿周围域神经元的存活。3.p75NTR的CRD结构域与Herp的泛素类似域存在相互作用。4.p75NTR通过促进Herp的泛素化降解使Herp表达减少,进而减少Herp对血肿周围神经元的保护作用,促进血肿周围神经元的凋亡。
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