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急性肾损伤（Acute kidney injury,AKI）是一种常见的以肾功能迅速下降、组织损伤为特征的临床综合征,属于复杂的重症肾脏疾病。世界流行病学调查显示,住院患者中AKI的发病率和死亡率超过20%,严重到需要透析的AKI患者的死亡率高达50%,已经成为国内外研究的热点和焦点。AKI的防治目前以对症治疗为主,主要包括可逆性病因的及时纠正、干预治疗、保持肾脏的生理环境稳定、感染的有效控制、营养支持以及防治并发症为主。改善全球肾脏病预后组织并未推荐任何用于预防和治疗AKI的药物,因此除了肾脏透析之外,目前尚无明显抑制肾脏损伤的特异性治疗方法。近年来研究者致力于寻找新的药物治疗和预防AKI。绞股蓝皂苷XLIX（Gypenoside XLIX,Gyp XLIX）是从绞股蓝总皂苷中分离得到的达玛烷型四环三萜类皂苷,可降低糖尿病肾病模型大鼠的肾小球滤过率、尿蛋白含量以及血糖、血脂各项指标,通过上调Bcl2蛋白表达,下调Bax和VCAM-1蛋白表达,从而对糖尿病肾病大鼠肾脏功能具有保护作用。课题前期研究发现Gyp XLIX对顺铂诱导的急性肾损伤小鼠模型具有一定的保护作用。本课题将从体内外方面进一步研究Gyp XLIX对急性肾损伤、缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤的保护作用,并探讨其可能机制;从口服生物利用度和体内药动学方面探讨其成药性,为临床急性肾损伤的防治提供新思路。1.Gyp XLIX对顺铂刺激的HK2细胞的保护作用采用MTT法筛选Gyp XLIX对HK2细胞的无毒剂量,并考察无毒剂量下Gyp XLIX对HK2细胞活力的影响。将细胞分成对照组、模型组及模型加药组,模型组用Cis（20μM）刺激24 h,模型加药组用Gyp XLIX预处理12h,再用Cis（20μM）处理24 h。收集细胞,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,通过Western blot和Real-time PCR方法检测各组细胞肾小管损伤分子KIM-1蛋白及mRNA表达的水平,检测细胞凋亡蛋白Cle-caspase-3,程序性坏死调控蛋白RIPK1,RIPK3和p-MLKL的蛋白及mRNA表达;通过Real-time PCR方法检测炎性因子TNF-α,IL-6和单核细胞趋化蛋白MCP-1的mRNA表达。MTT结果显示,0.5至128μM范围内随着浓度的升高,HK2细胞的活力逐渐增强,并无抑制现象。顺铂刺激造成了HK2细胞超过50%的抑制率,而32、64、128μM浓度的Gyp XLIX均可显著提升HK2细胞受顺铂刺激后的生存率。Gyp XLIX处理组肾小管细胞损伤减轻;KIM-1的mRNA和蛋白的表达量降低;炎症相关因子MCP-1、IL-6、TNF-α的mRNA水平下降;程序性坏死相关蛋白RIPK1、RIPK3及凋亡相关蛋白Cle-caspase-3的蛋白表达均明显下调。以上结果表明,Gyp XLIX对顺铂刺激的HK2细胞具有一定的保护作用。2.Gyp XLIX对缺氧/复氧损伤HK2细胞的保护作用细胞在37℃,5%CO2的培养箱,含5%FBS的DMEM-F12培养基中生长至60%,将细胞转至37℃的无血清、低糖培养基（94%N2、5%CO2和1.0%O2）中培养12 h。随后,将细胞在含2%FBS的DMEM-F12培养基中培养6 h,进行复氧。模型加药组用Gyp XLIX预处理24 h。同上检测HK2细胞肾小管损伤分子KIM-1蛋白、炎症及细胞程序性死亡相关指标的变化,结果显示,Gyp XLIX处理组肾小管细胞损伤减轻;KIM-1的mRNA和蛋白的表达量降低;炎症相关因子MCP-1,IL-6,TNF-α的mRNA表达下降;程序性坏死相关蛋白RIPK1,RIPK3及凋亡相关蛋白Cle-caspase-3的蛋白表达均明显下调。以上结果表明,Gyp XLIX对缺氧/复氧刺激的HK2细胞具有一定的保护作用。3.Gyp XLIX对顺铂诱导的急性肾损伤小鼠模型的保护作用将40只6-8周龄,体重18-20 g的C57BL/6小鼠适应性饲养1周,随机分为正常组、模型组和模型给药组（低、中、高剂量组）。正常组（NC组）腹腔注射生理盐水作为对照;模型组腹腔注射20 mg/kg的顺铂诱导急性肾损伤模型。模型给药组先采用25,50,100 mg/mL的Gyp XLIX溶液腹腔注射预处理,12 h后腹腔注射20 mg/kg的顺铂,连续给Gyp XLIX 3天后麻醉状态下处理,取血和肾脏组织。结果表明,与模型组相比,Gyp XLIX处理组肾小管的细胞损伤减轻;肌酐和尿素氮含量明显降低;KIM-1的mRNA和蛋白的表达量降低;炎症相关因子MCP-1、IL-6、TNF-α的mRNA表达下降;程序性坏死相关蛋白RIPK1、RIPK3及凋亡相关蛋白Cle-caspase-3的表达均明显下调。4.Gyp XLIX对缺血再灌注诱导的急性肾损伤小鼠模型的保护作用将6-8周龄,体重18-20 g的C57BL/6小鼠适应性饲养1周,随机分为假手术组（Shame组）、缺血再灌注模型组（IRI组）、模型给药组（Gyp组）。在IRI手术前3天腹腔注射Gyp XLIX（50 mg/kg）,每日1次。建立IRI模型24 h后,取血和肾脏组织备用。结果表明,与模型组相比,Gyp XLIX治疗组肾小管的细胞损伤减轻;肌酐和尿素氮含量明显降低;KIM-1的mRNA和蛋白的表达量降低;炎症相关因子MCP-1,IL-6,TNF-α的mRNA表达下降;程序性坏死相关蛋白RIPK1,RIPK3及凋亡相关蛋白Cle-caspase-3的表达均明显下调。以上结果表明,在小鼠体内Gyp XLIX对缺血再灌注诱导的急性肾损伤具有一定的保护作用。5.Gyp XLIX对顺铂诱导的急性肾损伤小鼠和HK2细胞保护机制将细胞分为A（空白对照组）、B（Cis组）、C（Gyp XLIX组）和D（Gyp XLIX+Cis组）组,采用RNA-seq技术对Gyp XLIX处理后肾小管上皮细胞HK-2细胞差异表达的mRNA进行筛选,筛选条件为FDR<0.05且|log2FC|>1;并应用生物信息学分析方法进行基因富集情况的分析,探讨Gyp XLIX对肾脏保护作用的机制。筛选结果显示Gyp XLIX可以下调IGF通路相关蛋白中IGFBP-7的表达,从而可能对IGF通路及其下游通路产生一定影响,影响肾脏细胞的凋亡、增殖。进一步验证结果显示,Gyp XLIX可下调IGFBP-7表达,上调p-IGF1R表达。通过siRNA沉默IGFBP-7基因发现,沉默IGFBP-7后不仅可以抑制顺铂诱导的KIM-1表达的升高、炎症反应以及细胞程序性坏死的发生,同时可以激活IGF通路,引起其下游PI3K-AKT-mTOR通路的激活,促进细胞增殖和修复,因此对顺铂诱导的肾脏损伤具有保护作用。6.Gyp XLIX体内药动学性质预测及大鼠体内药动学、组织分布研究药动学研究表明,Gyp XLIX口服吸收较为迅速,体内滞留时间较长,可快速分布到大鼠全身器官,在肾脏中浓度较高,为其临床用于治疗急性肾损伤提供了较好的基础,但是存在口服生物利用度较低的情况,可进一步研究其体内代谢过程及寻求提高其生物利用度的方法,为其临床应用奠定理论基础。综上所述,本课题研究发现在顺铂诱导的AKI和缺血再灌注损伤引起的AKI小鼠模型中、顺铂刺激的HK2细胞以及缺氧\复氧HK2细胞中,Gyp XLIX不仅可以抑制的KIM-1的表达,抑制炎症、凋亡和程序性坏死,还可通过下调IGFBP-7表达,上调p-IGF1R表达,激活IGF通路,进而活化下游PI3K-AKT-mTOR通路,促进细胞增殖,对急性肾损伤模型产生保护作用。Gyp XLIX水溶性小,分子量大,在体内快速分布,在肾脏中浓度较高,但是生物利用度低,后期将进行体内药物代谢和制剂学研究,为急性肾损伤的防治提供新的思路。