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目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一种兼性胞内菌,侵入胃黏膜上皮细胞是H.pylori导致胃黏膜病理改变的机制之一,但其侵袭机制尚不明确。β1整合素(integrinβ1)是H.pylori侵袭相关的细胞受体,H.pylori的Cag I、Cag L和Cag A均能与之结合,本实验室的既往研究已证明Cag L和Cag A均与H.pylori的侵袭功能相关。已知cag I和cag L是H.pylori IV型分泌系统的重要毒力基因,有研究表明cag I和cag L相互作用形成复合物,且cag I可影响Cag L的表达量。因此,本研究拟探究cag I是否与H.pylori侵袭相关,及cag I与cag L和cag A的侵袭细胞功能强弱是否有别。研究目的在于揭示H.pylori侵袭机制,为H.pylori致病作用和机制的研究提供一定的参考意义和新思路。方法:1、构建幽门螺杆菌NCTC11637cag I基因缺失株NCTC11637Δcag I根据NCBI H.pylori J99全基因组序列,设计引物,获得上下游基因片段,运用基因敲除同源重组原理将卡那霉素抗性基因(kana R)连接到PCR扩增的上下游基因片段cag L和cag H之间,并共同插入到p Bluescript SKⅡ(-)载体,构建出带卡那霉素抗性标志的重组质粒。将重组质粒转化到含完整cag I基因的标准株NCTC11637中,卡那霉素筛选出cag I基因缺失的幽门螺杆菌突变株,并经染色镜检,尿素酶及DNA、RNA水平鉴定,获得正确的缺失株。2、构建幽门螺杆菌NCTC11637cag L/I双基因缺失株NCTC11637Δcag L/I根据NCBI H.pylori J99全基因序列,设计引物,获得上下游基因片段,运用基因敲除同源重组原理将卡那霉素抗性基因(kana R)连接到PCR扩增的上下游基因片段cag N和cag H之间,并共同插入到p Bluescript SKⅡ(-)载体,构建出带卡那霉素抗性标志的重组质粒。将重组质粒转化到含完整cag L和cag I基因的标准株NCTC11637中,卡那霉素筛选出cag L和cag I基因缺失的幽门螺杆菌突变株,并经染色镜检,尿素酶及DNA、RNA水平鉴定,获得正确的缺失株。3、cag I、cag L及cag A基因的表达量检测设H.pylori NCTC11637Δcag I、NCTC11637Δcag L(已由本实验室构建)和NCTC11637Δcag A(已由本实验室构建)为实验组,H.pylori NCTC11637为对照组,分别提取RNA,并逆转录成c DNA,以c DNA为模板,采用q RT-PCR方法分别测定cag I、cag L及cag A基因的表达量。4、庆大霉素保护性侵袭实验以H.pylori NCTC11637Δcag I、NCTC11637Δcag L、NCTC11637Δcag L/I、NCTC11637Δcag A和NCTC11637分别感染AGS细胞(MOI=50,MOI为细菌数和细胞数的比值);一组细胞于感染2h后洗涤裂解,将裂解物涂布细菌培养板,培养后进行菌落计数,此为粘附细胞细菌数,计算粘附率(粘附细胞菌数/感染细胞菌数×100%);另一组细胞于感染2h后进行庆大霉素保护性侵袭实验(2h),裂解细胞,裂解物涂布细菌培养板,培养后进行菌落计数,此为侵入细胞菌数,计算侵袭粘附比(侵入细胞菌数/粘附细胞菌数×100%)。5、统计学分析采用SPSS22.0进行非参数秩和检验分析进行数据统计结果:1、成功构建了幽门螺杆菌NCTC11637cag I缺失株(NCTC11637Δcag I)及NCTC11637 cag L/I缺失株(NCTC11637Δcag L/I)。2、cag I、cag L及cag A基因在NCTC11637Δcag I、NCTC11637Δcag L和NCTC11637Δcag A中的表达量NCTC11637Δcag I的cag I、cag L、cag A基因表达量分别为0.00179±0.00044、0.00385±0.0032、0.93830±0.0276,与NCTC11637相比,NCTC11637Δcag I的cag I和cag L基因表达量降低,cag A基因表达量不变;NCTC11637Δcag L的cag I、cag L、cag A基因表达量分别为0.97391±0.35477、0.00261±0.00204、0.79419±0.12600,与NCTC11637相比,NCTC11637Δcag L的cag L基因表达量显著降低,cag I和cag A基因表达量不变;NCTC11637Δcag A的cag I、cag L、cag A基因表达量分别为1.00621±0.47831、1.00233±0.50291、0.000012±0.000008,与NCTC11637相比,NCTC11637Δcag A的cag A基因表达量显著降低,cag I和cag L基因表达量不变。3、庆大霉素保护性侵袭实验结果H.pylori NCTC11637Δcag I、NCTC11637Δcag L、NCTC11637Δcag L/I、NCTC11637Δcag A和NCTC11637对AGS细胞侵袭粘附比分别为7.88±0.82%、5.88±1.52%、5.43±1.54%、4.62±1.29%、20.41±5.77%,经非参数秩和检验分析:NCTC11637Δcag I、NCTC11637Δcag L、NCTC11637Δcag L/I及NCTC11637Δcag A的侵袭粘附比均显著低于NCTC11637(P<0.05);NCTC11637Δcag I分别与NCTC11637Δcag L、NCTC11637Δcag L/I的侵袭粘附比均无显著性差异(P>0.05);NCTC11637Δcag L与NCTC11637Δcag L/I的侵袭粘附比无显著性差异(P>0.05);NCTC11637Δcag L与NCTC11637Δcag A侵袭粘附比无显著性差异(P>0.05)。结论:1、cag I在基因转录水平影响了cag L的表达。2、cag I与幽门螺杆菌侵袭细胞功能相关。3、幽门螺杆菌cag I、cag L及cag A细胞侵袭能力无强弱差异,但可能起主要作用的侵袭因子是cag A。